Overview
Il pesce zebra (Danio rerio) è un potente sistema modello di vertebrati per lo studio dello sviluppo, la modellazione della malattia e lo screening per nuove terapie. A causa delle loro piccole dimensioni, un gran numero di pesci zebra può essere ospitato in laboratorio a basso costo. Sebbene i pesci zebra siano relativamente facili da mantenere, è necessario prestare particolare attenzione sia alla dieta che alla qualità dell'acqua al fine di ottimizzare la salute dei pesci e il successo riproduttivo.
Questo video fornirà una panoramica dell'allevamento e della manutenzione del pesce zebra in laboratorio. Dopo una breve rassegna dell'habitat naturale del pesce zebra, verranno discusse le tecniche essenziali per ricreare questo ambiente in laboratorio, compresi gli elementi chiave dei sistemi di ricircolo dell'acqua della struttura ittica e la preparazione dei gamberetti in salamoia come parte della dieta del pesce zebra. Inoltre, la presentazione includerà informazioni su come specifici ceppi di zebrafish vengono tracciati in un ambiente di laboratorio, con specifico riferimento alla raccolta di campioni di pinne caudali per l'estrazione del DNA e la genotipizzazione. Infine, le modifiche sperimentali dell'ambiente del pesce zebra saranno discusse come mezzo per approfondire la nostra comprensione di questi pesci e, a sua volta, di noi stessi.
Procedure
Una corretta allevamento è essenziale per il successo degli esperimenti eseguiti nel pesce zebra. La qualità ottimale dell'acqua favorisce la salute dei pesci e la riproducibilità sperimentale. Inoltre, la produzione di uova di zebrafish dipende fortemente da una corretta alimentazione. Questo video descrive come i pesci sono alloggiati e nutriti in laboratorio, suggerimenti su come gestire e gestire gli stock e uno sguardo su come l'ambiente del pesce zebra viene manipolato negli esperimenti biologici.
Iniziamo andando oltre le basi dell'habitat dei pesci.
Il pesce zebra selvatico proviene dalle fresche acque dell'Himalaya. In questo clima, i pesci trascorrono la maggior parte delle loro giornate crogiolandosi in corpi d'acqua dolce che si muovono lentamente.
Come viene ricreato questo paradiso in laboratorio? Iniziamo con la parte più importante: l'acqua. Sebbene l'acqua dolce possa sembrare facile da ottenere, l'acqua del rubinetto è tossica per i pesci zebra a causa del cloro e dei potenziali contaminanti. Pertanto, l'acqua dell'acquario deve essere passata attraverso un sistema di purificazione, come un'unità di osmosi inversa. Sali e tamponi di pH vengono quindi aggiunti di nuovo all'acqua purificata per ottimizzare la salinità e il pH.
Per massimizzare l'efficienza sperimentale, molti pesci vengono mantenuti in una quantità limitata di acqua. I rifiuti si accumulano rapidamente con tutti quei pesci che nuotano intorno, rendendo essenziale il cambio d'acqua. Questa necessità crea un'elevata domanda di acqua, quindi le strutture ittiche utilizzano un sistema di ricircolo per ridurre al minimo l'uso di acqua. L'acqua sporca viene filtrata e sterilizzata mediante trattamento UV prima di rifluire nel sistema.
I pesci zebra sono tenuti in vasche specializzate, disponibili in più dimensioni. Le vasche sono coperte per ridurre l'evaporazione e impedire la fuoriuscita dei pesci. Per consentire al serbatoio di integrarsi nel sistema, il coperchio ha fori attraverso i quali scorre costantemente acqua pulita. Il livello dell'acqua rimane stabile grazie a una porta di troppopieno sul retro del serbatoio, che è coperto da un deflettore con piccoli fori che consentono all'acqua sporca, ma non al pesce, di fuoriuscita.
Nonostante lo scambio d'acqua, le alghe e i rifiuti solidi possono ancora accumularsi nei serbatoi, quindi devono essere puliti regolarmente.
Anche il controllo ambientale negli impianti ittici è estremamente importante. La temperatura viene mantenuta vicino a 28 ° C o 80 ° F. Per mantenere il ritmo circadiano degli animali, le luci sono controllate su un ciclo con 14 ore di luce e 10 ore di oscurità.
Ora che abbiamo esaminato le condizioni abitative dei pesci zebra, parliamo della loro dieta.
Nel loro habitat naturale, i pesci zebra consumano in gran parte zooplancton e insetti. Questa dieta è ricreata in laboratorio da una combinazione di cibo secco e piccoli organismi. I pesci larvali e giovanili prosperano su microrganismi vivi come la paramecia, mentre i pesci adulti sono spesso nutriti con polveri disponibili in commercio e piccoli crostacei noti come gamberetti salamoia.
Queste creature sono particolarmente suscettibili alla preparazione di laboratorio, perché le loro uova possono essere conservate come cisti dormienti a temperatura ambiente. Per preparare i gamberetti per mangiare, i loro gusci esterni duri vengono rimossi mediante trattamento con candeggina. Successivamente, le uova decapsulate vengono lavate accuratamente. Le uova vengono poi trasferite in una torre aerata per consentire la crescita in acqua salata per circa un giorno. Infine, i gamberetti schiusi vengono raccolti e risciacquati in un colino a rete e quindi messi in bottiglie per l'alimentazione. I pesci vengono generalmente nutriti 2 - 3 volte al giorno, alternando mangimi vivi e secchi, e il flusso d'acqua viene disattivato durante questo periodo in modo che il cibo non galleggi via prima di essere mangiato.
Ora che sai come ospitare e nutrire i pesci, è tempo di imparare come lavorare e tenere traccia dei tuoi stock ittici.
Le strutture ittiche di laboratorio ospitano molti tipi diversi di zebrafish, dai ceppi wildtype, ai pesci i cui genomi sono stati modificati con mutazioni puntiformi dirompenti e transgeni inseriti. Per tenere traccia di tutti questi pesci, gli animali con background genetici simili sono tenuti insieme in vasche etichettate. Le etichette delle cisterne dovrebbero contenere informazioni identificative approfondite, tra cui il genotipo e la data di nascita del pesce.
La fertilità del pesce zebra inizia a diminuire dopo il primo anno di vita, quindi gli stock dovrebbero essere reintegrati ogni anno. I pesci zebra non sopravvivono bene come ceppi completamente consanguinei, quindi la diversità genetica deve essere mantenuta raccogliendo la progenie da incroci di pesci non correlati, o "outcrosses".
Quando si attraversano linee transgeniche o mutanti, la progenie portatrice della modificazione genetica desiderata deve essere identificata mediante espressione di fluorofori o genotipizzazione. Per genotipizzare, prima anestetizzare il pesce in tricaina. Quindi, taglia un piccolo pezzo della pinna caudale come fonte di DNA.
Infine, isolare il DNA dal campione di coda e utilizzarlo per l'analisi PCR per identificare sequenze specifiche. In attesa dei risultati, tieni ogni pesce nel suo piccolo acquario etichettato con un identificatore.
Ora che abbiamo esaminato le condizioni standard di allevamento dei pesci, diamo un'occhiata ad alcuni modi in cui questi standard sono manipolati per studiare i processi biologici.
La temperatura dell'acqua del sistema può influenzare profondamente la salute del pesce zebra. Per creare un modello di diabete mellito, questi ricercatori trattano i pesci con la tossina pancreatica, la streptozocina, e li ospitano in vasche con temperatura dell'acqua ridotta. I pesci diabetici mostrano fenotipi attesi, come danni ai reni e agli occhi, nonché una ridotta rigenerazione della pinna caudale e possono essere utilizzati per esaminare la biologia del diabete.
I sistemi di serbatoi possono anche essere modificati per scopi sperimentali specifici. Gli studi sul comportamento del nuoto nei pesci possono essere usati come lettura per ansia, aggressività o comportamenti sociali. Qui, il monitoraggio video viene utilizzato per analizzare la differenza nel comportamento di nuoto tra i pesci non trattati e quelli trattati con un farmaco neuroattivo. Studi come questi aiutano a far progredire la nostra comprensione delle neuroscienze e possono essere uno strumento per la scoperta di farmaci.
Condizioni di luce alterate possono anche influenzare il pesce zebra. Il trattamento con luce intensa può anche essere utilizzato per ablare le cellule sensibili alla luce della retina. Questi pesci hanno la capacità di riparare il tessuto retinico danneggiato dalla proliferazione cellulare, che è di notevole interesse per gli scienziati che studiano la degenerazione retinica nelle persone.
Hai appena visto il video di JoVE sulla manutenzione e l'allevamento dei pesci zebra. Abbiamo esaminato gli elementi essenziali di come i pesci sono alloggiati, nutriti e gestiti in laboratorio. Grazie per l'attenzione!
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
