Overview
I pulcini (Gallus gallus domesticus) sono un prezioso strumento di ricerca, non solo per studiare concetti importanti nello sviluppo dei vertebrati, nelle neuroscienze e nella biologia dei tumori, ma anche come un sistema efficiente in cui propagare i virus. Sebbene le uova possano essere acquistate da fornitori esterni e lavorare con i pulcini richieda pochissime attrezzature specializzate, è necessaria una comprensione delle corrette procedure di manipolazione per il normale sviluppo dell'embrione.
Questo video fornirà una panoramica dei principi di gestione delle uova, inclusa una spiegazione dei parametri di incubazione che possono avere un impatto profondo sullo sviluppo: temperatura, umidità e rotazione delle uova. La maggior parte degli esperimenti che utilizzano uova di gallina richiedono l'accesso all'embrione all'interno del guscio, che si ottiene tagliando un piccolo foro richioibile o "finestra". Questo processo è descritto in dettaglio passo-passo, insieme a molte altre tecniche essenziali per lavorare con i pulcini, come il candling e l'iniezione di inchiostro indiano. Infine, il video esaminerà alcune applicazioni pratiche di queste tecniche di base nella ricerca scientifica avanzata.
Procedure
Gli embrioni di pollo sono un ottimo modello per studiare lo sviluppo precoce dei vertebrati, in parte perché sono facili e poco costosi da mantenere. A differenza della maggior parte degli organismi modello, che vengono allevati in laboratorio, le uova di gallina fecondate vengono acquistate da un fornitore esterno. Inoltre, mantenere e lavorare con le uova richiede pochissime attrezzature specializzate. Questo video fornirà informazioni generali sull'acquisizione e il mantenimento delle uova di pulcino, le tecniche essenziali per lavorare con gli embrioni in via di sviluppo e alcune applicazioni pratiche di questi metodi.
Prima di discutere di lavorare con i pulcini in laboratorio, esaminiamo come le galline si prendono cura delle loro uova a casa. Sebbene le uova siano già fecondate quando vengono deposte, lo sviluppo dei pulcini si ferma quando le uova sono esposte a temperature esterne più fredde. Dopo aver deposto circa 12 uova, la gallina si siede sul nido per riprendere lo sviluppo dell'embrione. Durante la loro incubazione, la gallina ruoterà le uova per riscaldarle uniformemente e impedire all'embrione di attaccarsi al guscio. Se tutto va bene, 21 giorni dopo, la mamma si ha una nidiata di pulcini.
Quindi, come fanno gli scienziati a raccogliere abbastanza uova per i loro esperimenti? Micron... potrebbe volerci un po ' di tempo. Poiché i polli sono ampiamente addomesticati, le uova fecondate possono essere facilmente ottenute da un incubatoio o da un allevamento. Le uova possono anche essere ordinate in fasi specifiche dello sviluppo.
Una volta che le uova sono arrivate in laboratorio, possono essere conservate a 13 - 16 °C per un massimo di 5 giorni. Quando sei pronto per svilupparsi, lascia che le uova si scaldino a temperatura ambiente, quindi trasferiscile in un'incubatrice a dondolo a 37 ° C con il 60% di umidità fino a quando non hanno raggiunto lo stadio desiderato.
La maggior parte degli esperimenti eseguiti sui pulcini richiede alcuni passaggi preparatori, come controllare se le uova che hai ricevuto sono state fecondate in primo luogo. Un approccio semplice è quello di utilizzare una fonte di luce intensa o una scatola di candler per illuminare l'uovo. Utilizzando questa tecnica, nota come candling, è possibile visualizzare strutture interne come i vasi sanguigni per confermare la presente di un embrione.
Lasciare l'uovo intatto migliora la sopravvivenza del pulcino, ma il guscio impedisce l'accesso all'embrione. Per risolvere questo problema, i ricercatori usano una tecnica chiamata windowing.
Inizia deponendo le uova su un fianco e segnando la parte superiore per identificare il lato a cui salirà l'embrione. Per evitare danni al tuorlo durante il taglio di una finestra, una piccola quantità di albumina, o albume d'uovo, viene rimossa per abbassare l'embrione lontano dal guscio. Per fare questo, prima sterilizzare il guscio pulendolo con etanolo al 70%. Dopo che il guscio si è asciugato, lisciare un pezzo di nastro adesivo sull'estremità smussata dell'uovo. Quindi, utilizzare un ago sterile per perforare il nastro e il guscio. Inserire l'ago verso il basso per evitare di danneggiare il tuorlo e rimuovere 5 ml di albumina. Infine, per evitare perdite di albumina, sigillare il foro con un altro pezzo di nastro.
Per tagliare il guscio, posiziona un pezzo di nastro adesivo sopra l'area che prevedi di finestrare. Usando un paio di forbici, fai un piccolo foro nel guscio e inizia a tagliare un'apertura circolare. Durante questo processo, il nastro impedirà a frammenti di guscio di cadere sull'embrione.
Anche dopo la finestra, gli embrioni in fase iniziale possono essere difficili da visualizzare a causa delle loro piccole dimensioni e trasparenza. Per migliorare il contrasto tra l'embrione e il tuorlo, è possibile utilizzare inchiostro indiano diluito e non tossico. L'inchiostro viene iniettato nel tuorlo sotto l'embrione e lasciato diffondere. L'embrione può ora essere visto in maggiore contrasto con lo sfondo scuro. A seguito di manipolazioni sperimentali, la finestra deve essere risigillata con nastro adesivo e l'uovo riposto nell'incubatrice.
Ora che hai familiarità con le tecniche di base per lavorare con le uova, vediamo come questi metodi vengono utilizzati per condurre esperimenti sugli embrioni di pollo.
Per iniziare, il candling può essere utilizzato per identificare la posizione delle strutture embrionali in uova intatte. Ad esempio, le membrane extraembrionali dell'embrione di pollo sono comunemente utilizzate per la propagazione dei virus. Per infettare la membrana, viene eseguito il candling per localizzare l'interfaccia tra la cavità allantoica e la sacca d'aria, al fine di iniettare il virus direttamente nella cavità allantoica senza danneggiare l'embrione. Dopo alcuni giorni di incubazione, un gran numero di particelle virali può essere raccolto dal liquido allantoico.
La finestra delle uova è una pratica estremamente utile in quanto consente l'accesso all'embrione per la sperimentazione. Molti esperimenti iniziano con la consegna del DNA in tessuti specifici tramite microiniezione. Gli elettrodi vengono quindi posizionati attorno al tessuto di interesse e viene applicato un campo elettrico per permeabilizzare temporaneamente la membrana cellulare e guidare gli acidi nucleici nella cellula.
Quando si conducono esperimenti su embrioni precoci, l'iniezione di inchiostro indiano è particolarmente utile per visualizzare tessuti trasparenti. Qui, il contrasto migliorato consente ai ricercatori di microiniettare una soluzione di DNA in domini di tessuto raffinato. In definitiva, questa tecnica può produrre cellule etichettate individualmente, che possono essere monitorate nel tempo per tracciare le divisioni cellulari.
Hai appena visto il video di JoVE sulla manutenzione dei pulcini. Questa presentazione ha riguardato la manipolazione e la manutenzione di base delle uova di gallina, le tecniche comuni per lavorare con i pulcini e alcuni esempi di come questi metodi vengono applicati nella ricerca biologica. Grazie per l'attenzione!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
