Overview
Os pintinhos (Gallus gallus domesticus) são uma valiosa ferramenta de pesquisa, não apenas para estudar conceitos importantes no desenvolvimento de vertebrados, neurociência e biologia tumoral, mas também como um sistema eficiente para propagar vírus. Embora os ovos possam ser adquiridos de fornecedores externos e trabalhar com filhotes requer muito pouco equipamento especializado, é necessário um entendimento dos procedimentos adequados de manuseio para o desenvolvimento normal de embriões.
Este vídeo fornecerá uma visão geral dos princípios de manuseio de ovos, incluindo uma explicação dos parâmetros de incubação que podem impactar profundamente o desenvolvimento: temperatura, umidade e rotação de ovos. A maioria dos experimentos que usam ovos de galinha requer acesso ao embrião dentro da casca, que é conseguido cortando um pequeno buraco selável, ou "janela". Esse processo é descrito em detalhes passo a passo, juntamente com várias outras técnicas essenciais para trabalhar com filhotes, como candling e injeção de tinta na Índia. Finalmente, o vídeo revisará algumas aplicações práticas dessas técnicas básicas em pesquisas científicas avançadas.
Procedure
Os embriões de frango são um ótimo modelo para estudar o desenvolvimento precoce de vertebrados, em parte porque são fáceis e baratos de manter. Ao contrário da maioria dos organismos modelo, que são criados em laboratório, ovos de galinha fertilizados são comprados de um fornecedor externo. Além disso, manter e trabalhar com os ovos requer muito pouco equipamento especializado. Este vídeo fornecerá um background geral sobre a aquisição e manutenção de ovos de pintinhos, técnicas essenciais para o desenvolvimento de embriões e algumas aplicações práticas desses métodos.
Antes de discutirmos trabalhar com filhotes no laboratório, vamos rever como as galinhas cuidam de seus ovos em casa. Embora os ovos já sejam fertilizados quando colocados, o desenvolvimento de filhotes pára quando os ovos são expostos a temperaturas externas mais frias. Depois de colocar cerca de 12 ovos, a galinha se senta no ninho para retomar o desenvolvimento de embriões. Durante sua incubação, a galinha irá girar os ovos para aquecê-los uniformemente e evitar que o embrião grude na casca. Se tudo correr bem, 21 dias depois, a mãe tem uma ninhada de garotas.
Então, como os cientistas coletam ovos suficientes para seus experimentos? Micrômetro... que poderia levar um tempo. Como as galinhas são amplamente domesticadas, os ovos fertilizados podem ser facilmente obtidos de um incubatório ou fazenda de criação. Os ovos podem até ser encomendados em estágios específicos de desenvolvimento.
Uma vez que os ovos tenham chegado ao laboratório, eles podem ser armazenados a 13 - 16 °C por até 5 dias. Quando estiver pronto para que eles se desenvolvam, deixe os ovos aquecerem à temperatura ambiente, depois transfira-os para uma incubadora de balanço a 37 °C com 60% de umidade até chegarem ao estágio desejado.
A maioria dos experimentos realizados em filhotes requer alguns passos preparatórios, como verificar se os óvulos que você recebeu foram fertilizados em primeiro lugar. Uma abordagem fácil é usar uma fonte de luz brilhante ou caixa de velas para iluminar o ovo. Utilizando essa técnica, conhecida como candling, estruturas internas como vasos sanguíneos podem ser visualizadas para confirmar que um embrião está presente.
Deixar o ovo intacto melhora a sobrevivência dos filhotes, mas a casca impede o acesso ao embrião. Para resolver esse problema, os pesquisadores usam uma técnica chamada janelas.
Comece colocando os ovos de lado e marcando a parte superior para identificar o lado para o qual o embrião irá subir. Para evitar danos à gema durante o corte de uma janela, uma pequena quantidade de albumina, ou clara de ovo, é removida para baixar o embrião para longe da casca. Para isso, esterilize primeiro a casca limpando-a com 70% de etanol. Depois que a casca secar, suavize um pedaço de fita sobre a extremidade cega do ovo. Em seguida, use uma agulha estéril para perfurar a fita e a casca. Insira a agulha para baixo para evitar danificar a gema e remova 5 ml de albumina. Por fim, para evitar o vazamento de albumina, sele o orifício com outro pedaço de fita.
Para cortar a casca, coloque um pedaço de fita sobre a área que você planeja janela. Usando uma tesoura, faça um pequeno buraco na casca e comece a cortar uma abertura circular. Durante esse processo, a fita evitará que fragmentos de concha caiam sobre o embrião.
Mesmo após a janela, embriões em estágio inicial podem ser difíceis de visualizar devido ao seu pequeno tamanho e transparência. Para melhorar o contraste entre o embrião e a gema, pode-se usar tinta não tóxica da Índia diluída. A tinta é injetada na gema sob o embrião e permitida a difusão. O embrião agora pode ser visto em maior contraste contra o fundo escuro. Após manipulações experimentais, a janela deve ser recados com fita adesiva e o ovo colocado de volta na incubadora.
Agora que você está familiarizado com técnicas básicas para trabalhar com ovos, vamos ver como esses métodos são usados para realizar experimentos em embriões de frango.
Para começar, o candling pode ser usado para identificar a localização de estruturas embrionárias em ovos intactos. Por exemplo, as membranas extraembriônicas do embrião de frango são comumente usadas para a propagação de vírus. Para infectar a membrana, o candling é realizado para localizar a interface entre a cavidade allantóica e o saco de ar, a fim de injetar vírus diretamente na cavidade allantónica sem danificar o embrião. Após alguns dias de incubação, um grande número de partículas virais pode ser colhido do fluido allantóico.
A janela de ovos é uma prática extremamente útil, pois permite o acesso ao embrião para experimentação. Muitos experimentos começam com a entrega de DNA em tecidos específicos via microinjeção. Os eletrodos são então colocados ao redor do tecido de interesse e um campo elétrico é aplicado para permeabiliizar temporariamente a membrana celular e conduzir os ácidos nucleicos para dentro da célula.
Ao realizar experimentos em embriões precoces, a injeção de tinta da Índia é especialmente útil para visualizar tecidos transparentes. Aqui, o contraste melhorado permite que os pesquisadores microinjetem uma solução de DNA em domínios de tecidos refinados. Em última análise, essa técnica pode produzir células rotuladas individualmente, que podem ser monitoradas ao longo do tempo para rastrear divisões celulares.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre a manutenção de garotas. Esta apresentação abordou o manuseio básico e a manutenção de ovos de galinha, técnicas comuns para trabalhar com filhotes e alguns exemplos de como esses métodos são aplicados em pesquisas biológicas. Obrigado por assistir!
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
