Summary
Overview
Hühner (Gallus gallus domesticus) sind nicht nur ein wertvolles Werkzeug für die Forschung, um wichtige Konzepte in der Wirbeltierentwicklung, Neurowissenschaft und Tumorbiologie zu untersuchen, sondern sie sind auch ein effizientes System, in welchem Viren vermehrt werden können. Auch wenn die Eier von externen Zulieferern gekauft werden können und das Arbeiten mit Küken wenig spezialisierte Ausrüstung erfordert, ist es wichtig die richtigen Verfahren ihrer Handhabung zu verstehen, die für eine normale Entwicklung des Embryos nötig sind.
Dieses Video gibt einen Überblick über die Grundlagen der Handhabung von Eiern, einschließlich einer Erklärung der Inkubationsparameter wie Temperatur, Luftfeuchte und das Rotieren der Eier, welche die Entwicklung tiefgreifend beeinflussen können. Die meisten Experimente, die mit Hühnereiern gemacht werden, erfordern den Zugang zu dem Embryo in der Schale, was durch das Schneiden eines kleinen, wieder verschließbaren Lochs, auch Fenster genannt, erreicht werden kann. Diese und einige andere wichtige Methoden für das Arbeiten mit Küken, wie das Schieren und die Injektion von Indien Tinte, werden Schritt für Schritt beschrieben. Zuletzt beschreibt das Video einige praktische Anwendungen dieser grundlegenden Methoden in der fortgeschrittenen wissenschaftlichen Forschung.
Procedure
Hühnerembryonen sind ein großartiges Modellsystem, um die frühe Wirbeltierentwicklung zu untersuchen, zum Teil weil sie einfach und billig zu erhalten sind. Anders als die meisten Modellorganismen, welche im Labor gezüchtet werden, werden befruchtete Hühnereier von einem externen Zulieferer gekauft. Außerdem braucht man sehr wenig spezialisierte Ausrüstung, um die Eier zu halten und mit ihnen zu arbeiten. Dieses Video stellt eine allgemeine Grundlage wie man Hühnereier erwirbt und erhält dar, behandelt wichtige Verfahren, um mit sich entwickelnden Embryos zu arbeiten, und spricht über einige praktische Anwendungen dieser Methoden.
Bevor wir behandeln wie man mit Küken im Labor arbeitet, wiederholen wir wie Hennen sich zu Hause um ihre Eier kümmern. Auch wenn die Eier schon befruchtet sind wenn sie gelegt werden, hört die Entwicklung der Küken auf, wenn die Eier den kühleren, externen Temperaturen ausgesetzt sind. Nachdem sie ca. 12 Eier gelegt hat, sitzt die Henne auf ihrem Nest, damit die Embryoentwicklung weitergeht. Während der Inkubation rotiert die Henne die Eier, um sie gleichmäßig zu wärmen, und um zu vermeiden, dass der Embryo sich an der Schale festsetzt. Wenn alles gut geht, hat die Mutter in 21 Tagen eine Brut Küken.
Wie bekommen Wissenschaftler genug Eier für ihre Experimente? Hmm…das könnte eine Weile dauern. Da Hühner weitläufig domestiziert sind, können befruchtete Eier leicht von einer Brutanstalt oder einem Bruthof erhalten werden. Die Eier können sogar in spezifischen Entwicklungsstufen bestellt werden.
Wenn die Eier im Labor ankommen, können sie bei 13-16°C für bis zu 5 Tage gelagert werden. Wenn man bereit ist die Eier entwickeln zu lassen, lässt man die Eier auf Zimmertemperatur aufwärmen und transferiert sie dann in einen schüttelnden Inkubator bei 37°C mit 60% Luftfeuchtigkeit, bis die gewünschte Entwicklungsstufe erreicht ist.
Die meisten Experimente, die mit Küken gemacht werden, erfordern ein paar vorbereitende Schritte, wie zum Beispiel das Sicherstellen dass die Eier, die man erhalten hat, tatsächlich auch befruchtet waren. Ein einfacher Weg ist eine helle Lichtquelle oder einen Eidurchleuchter zu benutzen, um das Ei zu durchleuchten. Mit dieser Methode, die auch als Schieren bekannt ist, können interne Strukturen, wie zum Beispiel Blutgefäße, visualisiert werden, um sicherzustellen, dass auch ein Embryo vorhanden ist.
Die Unversehrtheit der Schale verbessert das Überleben des Kükens, aber sie verhindert, dass man den Embryo erreichen kann. Um dieses Problem zu lösen haben Forscher das „Fensterverfahren“ entwickelt.
Man fängt an das Ei auf die Seite zu legen und markiert die Oberseite, um die Seite zu identifizieren, auf welche der Embryo hin wächst. Um zu vermeiden, dass das Dotter durch das Schneiden des Fensters beschädigt wird, wird ein kleines bisschen Albumin, oder Eiweiß, entfernt, wodurch der Embryo sich weg von der Schale bewegt. Dafür sterilisiert man zuerst die Schale durch Abwischen mit 70% Ethanol. Nachdem die Schale getrocknet ist, schiebt man ein Stück Klebestreifen über das stumpfe Ende des Eies. Dann benutzt man eine Sterile Nadel, um das Klebeband und die Schale zu durchbrechen. Man führt die Nadel nach unten ein damit das Dotter nicht beschädigt wird, und entfernt 5 ml des Albumins. Zuletzt versiegelt man das Loch mit einem anderen Stück Klebeband, um zu verhindern, dass Albumin ausläuft.
Um die Schale zu schneiden, klebt man ein Stück Klebeband über das Gebiet, wo man das Fenster einfügen möchte. Mit einer Schere macht man ein kleines Loch in die Schale und fängt an eine kreisförmige Öffnung zu schneiden. Während dieses Prozesses verhindert das Stück Klebeband, dass die Schale in den Embryo fällt.
Auch nach dem Einfügen des Fensters kann es sein, dass Embryonen im Frühstadium wegen ihrer Größe und ihrer Durchsichtigkeit schwer zu visualisieren sind. Um den Kontrast zwischen dem Embryo und dem Dotter zu verbessern, kann verdünnte, nicht giftige Indien Tinte benutzt werden. Die Tinte wird in das Dotter unter dem Embryo injiziert und kann sich dann verbreiten. Der Embryo kann nun mit einem höheren Kontrast gegen einen dunklen Hintergrund gesehen werden. Nach experimentellen Veränderungen sollte das Fenster mit Klebeband wieder verschlossen und das Ei zurück in den Inkubator gelegt werden.
Nun dass wir die grundlegenden Methoden kennen, die man braucht, um mit Eiern zu arbeiten, sehen wir wie diese Methoden verwendet werden, um Experimente in Hühnerembryos ausführen.
Um anzufangen kann man das Schieren benutzen, um die Lage der embryonalen Strukturen in dem intakten Ei zu bestimmen. Zum Beispiel werden die extraembryonalen Membranen des Hühnerembryos häufig für die Vermehrung von Viren benutzt. Um die Membran zu infizieren, wendet man das Schieren an, um die Lage der Trennfläche zwischen dem Allantoisack und dem Luftsack zu bestimmen. Dann injiziert man den Virus direkt in den Allantoisack ohne den Embryo zu beschädigen. Nach ein paar Tagen Inkubation können eine große Anzahl von Viruspartikeln aus der Allantoisflüssigkeit geerntet werden.
Ein Fenster in das Ei einzufügen ist ein extrem hilfreiches Werkzeug, das uns Zugriff auf den Embryo für Experimente ermöglicht. Viele Experimente fangen mit der Lieferung der DNA in spezifische Gewebe mit der Mikroinjektion an. Elektroden werden dann um das Gewebe von Interesse platziert, und ein elektrisches Feld wird temporär angewendet, um die Zellmembran durchlässig zu machen und die Nukleinsäuren in die Zelle einzufügen.
Wenn man Experimente mit Embryonen im Frühstadium macht, kann Indien Tinte injiziert werden, die besonders nützlich ist, um transparente Gewebe darzustellen. Hier ermöglicht der verbesserte Kontrast dem Forscher die DNA Lösung in feine Gewebedomänen zu injizieren. Letztendlich kann dieses Verfahren in einzeln gekennzeichnete Zellen resultieren, welche dann mit der Zeit beobachtet werden können, um Zellteilungen nachzuverfolgen.
Das war JoVE’s Video über die Haltung von Küken. Diese Präsentation hat die grundlegende Handhabung und Haltung von Hühnereiern, allgemeine Methoden um mit Küken zu arbeiten, und einige Beispiele wie diese Methoden in der biologischen Forschung angewendet werden, gezeigt. Danke für eure Aufmerksamkeit.
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