Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

באובו אלקטרופורציה של עוברי עוף
 
Click here for the English version

באובו אלקטרופורציה של עוברי עוף

Overview

אלקטרופורציה היא טכניקה המשמשת במחקר ביו-רפואי המאפשרת מניפולציה של ביטוי גנים באמצעות אספקת חומר גנטי זר לתאים. ליתר דיוק, ב ovo electroporation מבוצע על אפרוחים מתפתחים מוקדם(גאלוס גאלוס ביתיות)הכלול בתוך קליפות הביצים שלהם. בהליך זה, DNA או מבנים נוקאאוט מוזרקים תחילה לתוך רקמת היעד. עם זאת, החומר הגנטי אינו מסוגל לחדור את קרום הפלזמה כדי לבצע את תפקידו בתוך התא. כדי לפתור בעיה זו, שדה חשמלי מוחל, גרימת שיבושים זמניים ליציבות הממברנה. שדה חשמלי זה גורם גם לחומצות הגרעין הטעונות השליליות לנדוד לכיוון האלקטרודה הטעונה באופן חיובי דרך החורים בקרום הפלזמה, ובכך למעשה מניע את ה- DNA או את מבנה ההפלה לתא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי משלוח של חומר גנטי יכול להיות מקומי לסוגי תאים מבודדים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות. כתוצאה מכך, ניתן לבחון את המנגנונים הגנטיים השולטים באירועים התפתחותיים בודדים.

וידאו זה מספק סקירה של העקרונות שמאחורי האלקטרופורציה של ovo ומציג את הכלים הדרושים לטכניקה, כולל מחטים נימיות, אלקטרודות ואלקטרופורטור. פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע ההליך מוצג גם לפני הדיון בכמה דוגמאות מרתקות לאופן שבו הטכניקה משמשת לביצוע מגוון מניפולציות גנטיות בעוברי תרנגולות.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אלקטרופורציה היא טכניקה המשמשת להכנסת חומר גנטי זר לתאים. אלקטרופורציה של עוברים אפרוח בתוך הביצה, או אלקטרופורציה ovo, הוא כלי בעל ערך עבור ביולוגים התפתחותיים כי משלוח של חומר גנטי יכול להיות מקומי לרקמות ספציפיות ונקודות זמן התפתחותיות ספציפיות. וידאו זה יציג את העקרונות הבסיסיים של אלקטרופורציה ovo, לתאר צעדים חיוניים של ההליך, ולדון כיצד טכניקה זו יכולה לשמש כדי ללמוד תהליכים ביולוגיים במהלך הפיתוח.

בתור התחלה, בואו נסקור את העקרונות הבסיסיים של אלקטרופורציה כדי להבין איך זה יכול לשמש כדי לקבל DNA לתוך תא.

ראשית, מיקרו-ינון משמש להעברת הדנ"א בסמיכות לתא מעניין. עם זאת, הדנ"א לא יכול לחדור את קרום הפלזמה כדי להיכנס לתא.

כדי לפתור בעיה זו, זרם חשמלי מוחל כדי לשבש את היציבות של הממברנה, יצירת נקבוביות. תוצאה שנייה של שדה חשמלי זה היא נדידת הדנ"א הטעון השלילית לכיוון האלקטרודה החיובית. כתוצאה מכך, רק תאים בצד של אתר ההזרקה קרוב יותר אלקטרודה חיובית להיות transfected עם ה- DNA.

עכשיו שאתם יודעים את העקרונות הבסיסיים, בואו נדבר על איך להכין עוברים לאלקטרופורציה. אם אתה צריך להשתמש בעוברים מבוגרים יותר המבורגר המילטון שלב 20, עדיף לתרבות האפרוחים שלך מחוץ הקליפה, או ex ovo, עבור גישה משופרת לרקמות. וידאו זה יתמקד אלקטרופורציות המבוצעות על עוברים מוקדמים המתפתחים בתוך הקליפה, או באובו.

בתור התחלה, ביצים צריך להיות דגירה באינקובטור לח ב 37 °C (50 °F) עד שהם הגיעו לשלב ההתפתחות הרצוי. בזמן שהביצים מדגרות, הכינו את הכלים להזרקה ואלקטרופורציה. ראשית, לעשות מחטים נימיות על ידי משיכת צינור זכוכית 0.5 מ"מ עם מושך צינור. כדי לפתוח את הצינור, מניחים אותו מתחת למיקרוסקופ ושוברים חתיכה קטנה מהקצה. לאחר מכן, להכין את פתרון ההזרקה, אשר צריך להכיל דילול מתאים של המבנה שלך, כמו גם צבע כדי לעזור לך לדמיין את הפתרון המוזרק.

כדי לשלוט בתנועת הנוזל בתוך המחט, חבר אותו לצינור פה המופעל על ידי אדם. לחלופין, ניתן לטעון את המחט על מיקרו-נג'ר, המספק פולסים מתכווננים של אוויר. מלא את המחט על ידי טביעת הקצה בתמיסת ההזרקה והחלת לחץ שלילי.

בנוסף למחטים, תצטרך גם אלקטרודות. אלה מורכבים משני חוטים חשופים קבועים יחד על ידי מתאם. זוג כבלים מחבר את האלקטרודות למחולל הפעימות החשמלי, או אלקטרופורטור, השולט על משך הדופק, התדירות והמתח. עבור פעולה ללא ידיים, האלקטרופורטור יכול להיות מופעל על ידי דוושת רגל.

לאחר הביצים מוכנות, לחתוך חלון בקליפה, ולהוסיף כמה טיפות של תמיסת מלח פיזיולוגית, כגון הנקס, כדי למנוע את העובר להתייבש. תחת מיקרוסקופ, למקם את הביצה כך רקמת העניין נגיש המחט. לאחר מכן, לנקב את העובר עם המחט נימי ולספק את הפתרון על ידי הפעלת לחץ עדין.

עכשיו שהזרקנו את המבנה, הגיע הזמן לבצע את האלקטרופורציה. מקם את האלקטרודות כך שהן שקועות בתמיסה של האנק ורקמת העניין מרוכזת ביניהן. על מנת ליישם את הזרם החשמלי, לחץ על דוושת כף הרגל וחפש בועות היוצרות סביב האלקטרודות.

לאחר האלקטרופורציה הושלמה, להסיר את האלקטרודות מן העובר ולנגב אותם עם 70% אתנול. מוסיפים כמה טיפות של תמיסת מלח בתוספת אנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום, ולאטום את החלון עם סרט הדבקה. לבסוף, מניחים את הביצים בחזרה באינקובטור להמשך הפיתוח לפני ניתוח פנוטיפי.

עכשיו שלמדנו הכל על אלקטרופורציה ovo, בואו נסתכל על כמה דוגמאות של איך מדענים מיישמים טכניקה זו במחקר התפתחותי.

בתור התחלה, אלקטרופורציה יכולה לשמש כדי לחסום ביטוי גנים על ידי משלוח של מבנים נוקאאוט. בדוגמה זו, תאים של הצינור העצבי המתפתח היו אלקטרופורציה עם מבנים השתקת גנים. העוברים הורשו להתפתח, ואז הושוו מסלולי אקסון בין דגימות רגילות ונוק-דאון כדי להעריך את השליטה הגנטית של הדרכת אקסון.

מצד שני, ב ovo electroporation יכול לשמש גם כדי לבטא חלבון בתת קבוצה של תאים על ידי החדרת plasmid המכיל גן קידוד חלבון ומקדם: רצף אשר קושר RNA פולימראז ליזום שעתוק. כאן, מדענים העבירו גן אחד לתאים של המוח העוברי. כתמי רקמות כדי לזהות הן את מוצר החלבון של גן זה והן סמנים של תת-סוגים עצביים ספציפיים מראה כי הגן האלקטרופורציה משנה את ההתפתחות העצבית.

DNA בונה קידוד חלבונים פלואורסצנטיים יכול להיות הציג גם על ידי אלקטרופורציה כדי לדמיין תאים ומבנים במהלך הפיתוח. זה מאפשר הדמיה חיה של תהליכים מורכבים, כגון פיתוח חוט השדרה, מתן תובנה על הדינמיקה של תנועות התא לאורך זמן.

הרגע צפית בהקדמה של JoVE לאלקטרופורציה של אובו, טכניקה שימושית להעברת חומר גנטי לאפרוחים. וידאו זה דן בעקרונות הבסיסיים של אלקטרופורציה, צעדים הנדרשים להזרקה אלקטרופורציה אפרוחים, ויישומים של טכניקה זו במחקר ההתפתחותי הנוכחי. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter