Overview
A eletroporação é uma técnica utilizada em pesquisas biomédicas que permite a manipulação da expressão genética através da entrega de material genético estrangeiro em células. Mais especificamente, na eletroporação ovo é realizada em filhotes em desenvolvimento precoce (Gallus gallus domesticus) contidos dentro de suas cascas de ovos. Neste procedimento, construções de DNA ou knockdown são injetadas pela primeira vez em um tecido alvo. No entanto, o material genético é incapaz de penetrar na membrana plasmática para realizar sua função dentro da célula. Para resolver esse problema, um campo elétrico é aplicado, causando interrupções temporárias na estabilidade da membrana. Este campo elétrico também faz com que os ácidos nucleicos carregados negativamente migrem em direção ao eletrodo carregado positivamente através dos orifícios na membrana plasmática, conduzindo efetivamente o DNA ou a construção de knockdown para dentro da célula. A maior vantagem dessa técnica é que a entrega de material genético pode ser localizada para tipos de células isoladas em pontos de tempo específicos de desenvolvimento. Como resultado, os mecanismos genéticos que regem eventos individuais de desenvolvimento podem ser examinados.
Este vídeo fornece uma visão geral dos princípios por trás na eletroporação de ovo e introduz as ferramentas necessárias para a técnica, incluindo agulhas capilares, eletrodos e um eletroporador. Um protocolo passo-a-passo para a realização do procedimento também é apresentado antes da discussão de alguns exemplos fascinantes de como a técnica é usada para realizar uma variedade de manipulações genéticas em embriões de frango.
Procedure
A eletroporação é uma técnica usada para introduzir material genético estrangeiro nas células. A eletroporação de embriões de filhotes dentro do ovo, ou na eletroporação ovo, é uma ferramenta valiosa para biólogos de desenvolvimento, pois a entrega de material genético pode ser localizada em tecidos específicos e pontos de tempo específicos de desenvolvimento. Este vídeo introduzirá os princípios básicos da eletroporação de ovo, descreverá etapas essenciais do procedimento e discutirá como essa técnica pode ser usada para estudar processos biológicos durante o desenvolvimento.
Para começar, vamos rever os princípios básicos da eletroporação para descobrir como ele pode ser usado para colocar DNA em uma célula.
Primeiro, a microinjeção é usada para entregar o DNA perto de uma célula de interesse. No entanto, o DNA não pode penetrar na membrana plasmática para entrar na célula.
Para resolver esse problema, uma corrente elétrica é aplicada para interromper a estabilidade da membrana, criando poros. Uma segunda consequência deste campo elétrico é a migração do DNA carregado negativamente para o eletrodo positivo. Como resultado, apenas células na lateral do local de injeção mais próximas do eletrodo positivo são transfectadas com o DNA.
Agora que você conhece os princípios básicos, vamos falar sobre como preparar embriões para eletroporação. Se você precisa usar embriões mais velhos que o Hamburger Hamilton estágio 20, é melhor cultivar seus filhotes fora da concha, ou ex ovo, para melhor acesso ao tecido. Este vídeo se concentrará em eletroporações realizadas em embriões precoces que se desenvolvem dentro da concha, ou em ovo.
Para começar, os ovos devem ser incubados em uma incubadora umidificada a 37 °C até atingirem o estágio de desenvolvimento desejado. Enquanto os ovos estão incubando, prepare as ferramentas para injeção e eletroporação. Primeiro, faça agulhas capilares puxando uma tubulação de vidro de 0,5 mm com um puxador de canos. Para abrir a tubulação, coloque-a sob um microscópio e quebre um pequeno pedaço da ponta. Em seguida, prepare a solução de injeção, que deve conter uma diluição adequada do seu construto, bem como um corante para ajudá-lo a visualizar a solução injetada.
Para controlar o movimento do fluido dentro da agulha, anexe-o a uma tubulação bucal alimentada por humanos. Alternativamente, a agulha pode ser carregada em um microinjetor, que fornece pulsos de pressão ajustáveis de ar. Encha a agulha submergindo a ponta na solução de injeção e aplicando pressão negativa.
Além de agulhas, você também precisará de eletrodos. Estes consistem em dois fios expostos fixados juntos por um adaptador. Um par de cabos conecta os eletrodos ao gerador de pulso elétrico, ou eletroporador, que controla a duração do pulso, a frequência e a tensão. Para a operação mãos livres, o eletroporador pode ser ativado por um pedal.
Uma vez que os ovos estejam prontos, corte uma janela na casca, e adicione algumas gotas de solução fisiológica de sal, como Hanks, para evitar que o embrião seque. Sob um microscópio, posicione o ovo de tal forma que o tecido de interesse seja acessível à agulha. Em seguida, fure o embrião com a agulha capilar e entregue a solução aplicando pressão suave.
Agora que injetamos a construção, é hora de realizar a eletroporação. Posicione os eletrodos para que fiquem submersos na solução do Hank e o tecido de interesse esteja centrado entre eles. Para aplicar a corrente elétrica, pressione o pedal do pé e procure bolhas que se formem ao redor dos eletrodos.
Quando a eletroporação estiver completa, remova os eletrodos do embrião e limpe-os com 70% de etanol. Adicione algumas gotas de solução de sal complementadas com antibióticos para evitar infecções, e sele a janela com fita adesiva. Por fim, coloque os ovos de volta na incubadora para o desenvolvimento contínuo antes da análise fenotípica.
Agora que aprendemos tudo sobre a eletroporação de ovo, vamos olhar para alguns exemplos de como os cientistas estão aplicando essa técnica em pesquisas de desenvolvimento.
Para começar, a eletroporação pode ser usada para bloquear a expressão genética por meio da entrega de construções de knockdown. Neste exemplo, as células do tubo neural em desenvolvimento foram eletroporadas com construções de silenciamento genético. Os embriões foram autorizados a desenvolver-se, e então as trajetórias de axônio foram comparadas entre amostras normais e knockdown para avaliar o controle genético da orientação do axônio.
Por outro lado, a eletroporação ovo também pode ser usada para expressar uma proteína em um subconjunto de células, introduzindo um plasmídeo contendo um gene codificador de proteínas e um promotor: uma sequência que liga a polimerase de RNA para iniciar a transcrição. Aqui, os cientistas entregaram um único gene em células do cérebro embrionário. A coloração tecidual para detectar tanto o produto proteico deste gene quanto marcadores de subtipos neurais específicos mostram que o gene eletroporado altera o desenvolvimento neural.
Construções de DNA codificando proteínas fluorescentes também podem ser introduzidas por eletroporação para visualizar células e estruturas durante o desenvolvimento. Isso permite imagens ao vivo de processos complexos, como o desenvolvimento da medula espinhal, dando uma visão da dinâmica dos movimentos celulares ao longo do tempo.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE na eletroporação ovo, uma técnica útil para entregar material genético em filhotes. Este vídeo discutiu os princípios básicos da eletroporação, etapas necessárias para injetar e eletroporar filhotes, e aplicações dessa técnica na pesquisa de desenvolvimento atual. Obrigado por assistir!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
