Overview
Un punto di forza del pollo (Gallus gallus domesticus) come organismo modello per la biologia dello sviluppo è che l'embrione si sviluppa al di fuori della femmina ed è facilmente accessibile per la manipolazione sperimentale. Molte tecniche consentono agli scienziati di esaminare gli embrioni di pollo all'interno del guscio d'uovo (in ovo), ma l'accesso embrionale può essere limitato nelle fasi successive dello sviluppo. Fortunatamente, i pulcini possono anche essere coltivati ex ovoo al di fuori del guscio d'uovo. Il principale vantaggio della coltura ex ovo è un maggiore accesso ai tessuti che altrimenti potrebbero essere ostruiti dal guscio o dall'orientamento del pulcino all'interno dell'uovo, specialmente per gli embrioni nelle fasi successive dello sviluppo.
Ci sono due strategie principali per la cultura ex ovo: la cultura del tuorlo intero e la cultura dell'espianto. Durante la coltura del tuorlo intero, il guscio d'uovo viene incrinato e il contenuto viene trasferito in un semplice recipiente di alloggiamento. Tuttavia, nei metodi di coltura di espianto, l'embrione viene asportato dal tuorlo e montato nel vaso di alloggiamento per mantenere la tensione della membrana, che è importante per il normale sviluppo.
In questo video verranno forniti protocolli di base per le tecniche di tuorlo intero ed espianto, insieme a una discussione sui pro e contro della coltivazione dei pulcini al di fuori del guscio. Infine, verranno discusse le applicazioni sperimentali della coltura ex ovo, dimostrando come questo approccio venga utilizzato per migliorare l'accesso all'embrione per la microscopia e la manipolazione genetica di embrioni in fase avanzata.
Procedure
Il pulcino è un organismo modello versatile per lo studio dei percorsi di sviluppo perché la maggior parte del suo sviluppo avviene al di fuori della madre. Tuttavia, il guscio d'uovo impedisce l'accesso all'embrione per alcune forme di sperimentazione. Fortunatamente, i pulcini possono essere incubati al di fuori del guscio, o"ex ovo",usando alcune forniture di laboratorio comunemente disponibili. In questo video, imparerai a conoscere i principi della cultura ex ovo, le procedure passo-passo per due diversi metodi di coltura e le applicazioni della tecnica negli studi sullo sviluppo.
Prima di parlare di come allevare i pulcini ex ovo,esaminiamo alcuni principi della tecnica. All'interno dell'uovo, il pulcino si sviluppa in stretta associazione con la membrana vitellina che circonda il tuorlo. Il volume rimanente è riempito con albumina, o albume d'uovo, che protegge l'embrione e funge da fonte di proteine.
La coltura al di fuori del guscio può essere eseguita tramite coltura del tuorlo intero, utilizzando tutto il contenuto dell'uovo in un semplice contenitore. In alternativa, i tessuti embrionali possono essere asportati e coltivati in coltura di espianto ex ovo. Entrambe queste tecniche hanno vantaggi distinti rispetto all'uso di uova finestrate.
In primo luogo, la finestra degli embrioni di pollo in fase successiva è complicata a causa della presenza di molti vasi sanguigni cruciali, che si sviluppano all'interno delle membrane che circondano il pulcino. Questo rende il metodo ex ovo preferibile per lavorare con i pulcini nelle fasi successive.
In secondo luogo, poiché possono adattarsi ai rig di imaging, le configurazioni di coltura ex ovo sono più suscettibili all'imaging ad alta risoluzione.
Inoltre, la rimozione di embrioni dal guscio espone un numero maggiore di tessuti per manipolazioni sperimentali come la microchirurgia e la microiniezione.
Poiché il pulcino si basa sul guscio d'uovo per la protezione e i minerali essenziali, la sopravvivenza dell'embrione senza questa struttura richiede alcune cure extra. Ad esempio, l'alloggiamento deve essere progettato per mantenere un ambiente sterile e umido e le sostanze nutritive devono essere fornite sotto forma di albumina o terreno di coltura. Per la coltura a lungo termine, il guscio schiacciato è anche richiesto come fonte di calcio. Inoltre, poiché la tensione sulle membrane che sostengono l'embrione è importante per il normale sviluppo, il successo della coltura ex ovo dipende anche dall'alloggiamento che mantiene la normale morfologia della membrana.
Ora che conosci le basi, è il momento di uscire! Per preparare le uova per la coltura del tuorlo intero ex ovo, iniziare incubandole a 37,5 °C fino a poco prima della fase desiderata.
Mentre stai aspettando, prepara l'alloggio. Le piastre di Petri, le barche di pesatura e le amache sono comunemente usate per contenere il contenuto delle uova. Innanzitutto, sterilizzare tutti i componenti mediante trattamento con luce UV o etanolo.
Inoltre, preparare una camera esterna riempita con acqua sterile per mantenere l'umidità durante l'incubazione.
Quando le uova sono pronte, metterle in posizione orizzontale per alcuni minuti in modo che l'embrione sali verso l'alto. Quindi rompere il fondo del guscio e trasferire con cura il contenuto dell'uovo nell'alloggiamento. Infine, coprire il recipiente dell'alloggiamento per mantenere l'umidità e posizionare la configurazione in un'incubatrice fino a raggiungere l'età desiderata per la lavorazione a valle.
Una strategia ex ovo alternativa, la coltura di espianto, richiede alcuni passaggi aggiuntivi dopo la rimozione dell'embrione dal guscio.
In questa tecnica, la membrana vitellina viene delicatamente separata dal tuorlo, portando con sé l'embrione in via di sviluppo.
Quindi, la membrana viene montata per mantenere la tensione, che può essere fatta tirando il tessuto stretto attorno a un anello di vetro o semplicemente aderenza alla carta da filtro.
Dopo il montaggio, il terreno di coltura viene aggiunto per coprire il tessuto e l'embrione viene posto in una camera umidificata.
Gli embrioni espiantati possono ora essere restituiti a un'incubatrice per un massimo di 24 ore di ulteriore sviluppo.
Dopo aver imparato i principi e i metodi della cultura ex ovo, siamo pronti per un po 'di gioco di polli.
la coltura ex ovo è particolarmente utile quando è necessario alterare l'espressione genica negli embrioni più anziani. Un approccio a questo è l'elettroporazione, in cui una corrente elettrica viene utilizzata per permeabilizzare le membrane cellulari per la consegna di materiale genetico. Poiché gli embrioni in coltura ex ovo sono anche altamente accessibili per l'imaging, l'assorbimento di materiale genetico può essere facilmente convalidato attraverso l'imaging fluorescente di embrioni interi.
L'imaging in tempo reale della dinamica cellulare è anche possibile utilizzando la coltura ex ovo. Le cellule tumorali umane possono formare tumori cooptando i vasi sanguigni della membrana corioallantoica del pulcino o CAM. Dopo la formazione del tumore, le particelle fluorescenti possono essere iniettate direttamente nel flusso sanguigno e tracciate in tempo reale. L'accumulo di particelle nel tessuto tumorale può essere utilizzato come indicatore di angiogenesi o formazione di nuovi vasi sanguigni.
Sebbene gli embrioni interi possano essere coltivati utilizzando tecniche di espianto, alcuni esperimenti richiedono che i tessuti embrionali siano sezionati prima della coltura. Ad esempio, lo sviluppo del tessuto neurale può essere asportato e coltivato su scivoli di copertura di vetro. Dopo un periodo di incubazione, si può osservare una specifica popolazione di cellule nota come cresta neurale che migra lontano dal tessuto. Il trattamento con agenti sperimentali e l'imaging timelapse possono quindi essere utilizzati per testare i fattori che controllano la migrazione cellulare.
Hai appena visto la guida di JoVE alla cultura dei pulcini ex ovo. Questo video ha coperto i principi della cultura ex ovo, le basi dei metodi di tuorlo intero ed espianto e alcuni dei modi in cui queste tecniche sono utilizzate nei laboratori oggi. Grazie per l'attenzione!
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
