Overview
כוח אחד של העוף (Gallus gallus domesticus) כאורגניזם מודל לביולוגיה התפתחותית הוא שהעובר מתפתח מחוץ לנקבה ונגיש בקלות למניפולציה ניסיונית. טכניקות רבות מאפשרות למדענים לבחון עוברים של תרנגולות בתוך קליפת הביצה (באובו), אך הגישה העוברית יכולה להיות מוגבלת בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות. למרבה המזל, אפרוחים יכולים גם להיות תרבותית ex ovo, או מחוץ קליפת הביצה. היתרון העיקרי לתרבות אובו לשעבר הוא גישה גדולה יותר לרקמות שעלולות להיות חסומים בדרך אחרת על ידי הקליפה או הכיוון של האפרוח בתוך הביצה, במיוחד עבור עוברים בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות.
ישנן שתי אסטרטגיות עקרוניות להפקת תרבות אובו: תרבות חלמון שלמה ותרבות מסבירה. במהלך תרבות החלמון כולה, קליפת הביצה סדוקה והתכולה מועברת לכלי דיור פשוט. עם זאת, בשיטות תרבות explant, העובר הוא נפלט מן החלמון ומותקן בכלי הדיור כדי לשמור על מתח הממברנה, אשר חשוב להתפתחות נורמלית.
פרוטוקולים בסיסיים לטכניקות חלמון מלא ורחבה יסופקו בסרטון זה, יחד עם דיון על היתרונות והחסרונות של אפרוחים פולחניים מחוץ לקונכייה. לבסוף, יישומים ניסיוניים של תרבות אובו לשעבר יידונו, המדגימים כיצד גישה זו משמשת לשיפור הגישה לעובר למיקרוסקופיה ומניפולציה גנטית של עוברים בשלב מאוחר.
Procedure
הגוזל הוא אורגניזם מודל רב-תכליתי לחקר מסלולים התפתחותיים מכיוון שרוב התפתחותו מתרחשת מחוץ לאם. עם זאת, קליפת הביצה מונעת גישה לעובר עבור צורות מסוימות של ניסויים. למרבה המזל, אפרוחים יכולים להיות דגירה מחוץ הקליפה, או "ex ovo," באמצעות כמה ציוד מעבדה זמין בדרך כלל. בסרטון זה תלמדו על העקרונות של תרבות האקס אובו, נהלים שלב אחר שלב לשתי שיטות תרבות שונות, ויישומים של הטכניקה בלימודים התפתחותיים.
לפני שמדברים על איך לגדל אפרוחים לשעבר ovo, בואו נעבור על כמה עקרונות של הטכניקה. בתוך הביצה, האפרוח מתפתח בקשר הדוק עם קרום vitelline המקיף את החלמון. הנפח הנותר מלא אלבומין, או לבן ביצה, אשר מגן על העובר ומשמש כמקור לחלבון.
תרבות מחוץ הקליפה יכולה להתבצע באמצעות תרבות חלמון שלם, באמצעות כל תכולת הביצה במיכל פשוט. לחלופין, ניתן לחתוך ולגדל רקמות עובריות בתרבות explant לשעבר. לשתי טכניקות אלה יש יתרונות ברורים על פני השימוש בביצים עם חלונות.
ראשית, חלונות עוברים עוף בשלב מאוחר יותר הוא מסובך בשל נוכחותם של כלי דם חיוניים רבים, אשר מתפתחים בתוך הממברנות המקיפות את האפרוח. זה הופך את שיטת אובו לשעבר עדיפה לעבודה עם אפרוחים בשלבים מאוחרים יותר.
שנית, מכיוון שהם יכולים להתאים לאסדות הדמיה, הגדרות תרבות אובו לשעבר נוחות יותר להדמיה ברזולוציה גבוהה.
יתר על כן, הסרת עוברים מן הקליפה חושפת מספר גדול יותר של רקמות עבור מניפולציות ניסיוניות כמו מיקרוכירורגיה ומיקרו-יז'ק.
מאז האפרוח מסתמך על קליפת הביצה להגנה ומינרלים חיוניים, הישרדות העובר ללא מבנה זה דורש קצת טיפול נוסף. לדוגמה, דיור חייב להיות מתוכנן כדי לשמור על סביבה סטרילית, לחה, וחומרים מזינים חייבים להיות מסופקים בצורה של אלבומין או מדיום תרבות. עבור תרבות ארוכת טווח, קליפה כתוש נדרש גם כמקור סידן. יתר על כן, מאז המתח על הממברנות התומכות העובר חשוב להתפתחות נורמלית, תרבות ex ovo מוצלחת בנוסף תלוי דיור השומר על מורפולוגיה ממברנה נורמלית.
עכשיו שאתה יודע את היסודות, הגיע הזמן להשתפן! כדי להכין ביצים לתרבות חלמון שלם ex ovo, להתחיל על ידי דגירה אותם ב 37 °C (5 °F) עד ממש לפני השלב הרצוי.
בזמן שאתה מחכה, להכין את הדיור. מנות פטרי, סירות שקילה וערסלים משמשים בדרך כלל להחזקת תכולת הביצה. ראשית, לחטא את כל הרכיבים על ידי טיפול עם אור UV או אתנול.
בנוסף, להכין תא חיצוני מלא במים סטריליים כדי לשמור על לחות במהלך הדגירה.
כאשר הביצים מוכנות, להגדיר אותם במצב אופקי במשך כמה דקות, כך העובר עולה למעלה. לאחר מכן לפצח את החלק התחתון של הקליפה בזהירות להעביר את תכולת הביצה לתוך הדיור. לבסוף, לכסות את כלי הדיור כדי לשמור על לחות, ולהניח את ההתקנה לתוך אינקובטור עד הגיל הרצוי הוא הגיע לעיבוד במורד הזרם.
אסטרטגיית ex ovo חלופית, תרבות explant, דורש כמה צעדים נוספים לאחר הסרת העובר מן הקליפה.
בטכניקה זו, קרום vitelline מופרד בעדינות מן החלמון, נושא את העובר המתפתח עם זה.
לאחר מכן, הממברנה מותקנת על מנת לשמור על מתח, אשר ניתן לעשות על ידי משיכת הרקמה הדוק סביב טבעת זכוכית או על ידי דבקות פשוטה נייר מסנן.
לאחר הרכבה, מדיום תרבות מתווסף כדי לכסות את הרקמה, ואת העובר ממוקם בתא לח.
כעת ניתן להחזיר את העוברים המוסברים לאינקובטור עד 24 שעות של התפתחות נוספת.
אחרי שלמדנו את העקרונות והשיטות של תרבות האקס אובו, אנחנו מוכנים לאיזה משחק עופות.
תרבות אובו לשעבר שימושית במיוחד כאשר אתה צריך לשנות ביטוי גנים בעוברים מבוגרים. גישה אחת לכך היא אלקטרופורציה, שבה זרם חשמלי משמש מחלחל קרום התא לאספקת חומר גנטי. מאז העוברים התרבותיים לשעבר אובו נגישים מאוד גם להדמיה, ספיגת חומר גנטי יכולה להיות מאומתת בקלות באמצעות הדמיה פלואורסצנטית של עוברים שלמים.
הדמיה בזמן אמת של דינמיקת תאים אפשרית גם באמצעות תרבות אובו לשעבר. תאים סרטניים אנושיים יכולים ליצור גידולים על ידי שיתוף פעולה כלי דם של קרום chorioallantoic אפרוח, או CAM. לאחר היווצרות הגידול, חלקיקי פלואורסצנטי ניתן להזריק ישירות למחזור הדם ולעקוב בזמן אמת. הצטברות של חלקיקים ברקמת הגידול יכולה לשמש כאינדיקטור לאנגיוגנזה, או היווצרות כלי דם חדשים.
למרות שניתן לתרבות עוברים שלמים בטכניקות הסברה, ניסויים מסוימים דורשים כי רקמות עובריות ינתחו לפני התרבות. לדוגמה, פיתוח רקמה עצבית ניתן לחתוך ולגדל על פתקי כיסוי זכוכית. לאחר תקופה של דגירה, ניתן לראות אוכלוסייה מסוימת של תאים המכונה הסמל העצבי נודד הרחק מהרקמה. טיפול עם סוכנים ניסיוניים והדמיה timelapse אז יכול לשמש כדי לבדוק גורמים השולטים בנדידת תאים.
הרגע צפית במדריך של ג'וב לתרבות האפרו-אובו. וידאו זה כיסה את העקרונות של תרבות אובו לשעבר, את היסודות של חלמון שלם ושיטות explant, וכמה דרכים טכניקות אלה משמשים במעבדות היום. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
