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Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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Chick ex ovo Cultura

Overview

Uma força da galinha (Gallus gallus domesticus) como um organismo modelo para biologia do desenvolvimento é que o embrião se desenvolve fora da fêmea e é facilmente acessível para manipulação experimental. Muitas técnicas permitem que os cientistas examinem embriões de frango dentro da casca de ovo (em ovo),mas o acesso embrionário pode ser limitado em estágios posteriores de desenvolvimento. Felizmente, os filhotes também podem ser cultivados ex ovo, ou fora da casca de ovo. A maior vantagem para a cultura ex ovo é o maior acesso a tecidos que poderiam ser obstruídos pela casca ou pela orientação do filhote dentro do ovo, especialmente para embriões em estágios posteriores de desenvolvimento.

Existem duas estratégias de princípio para ex-cultura ovo: cultura de gema inteira e cultura explant. Durante toda a cultura da gema, a casca de ovo é rachada e o conteúdo é transferido para um simples vaso habitacional. No entanto, nos métodos de cultura explant, o embrião é extirpado da gema e montado no vaso habitacional para manter a tensão da membrana, o que é importante para o desenvolvimento normal.

Protocolos básicos para técnicas de gema integral e explant serão fornecidos neste vídeo, juntamente com uma discussão sobre os prós e contras de filhotes de cultura fora da concha. Finalmente, serão discutidas aplicações experimentais da cultura ex ovo, demonstrando como essa abordagem é usada para melhorar o acesso ao embrião para microscopia e manipulação genética de embriões em estágio final.

Procedure

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O filhote é um organismo modelo versátil para o estudo de caminhos de desenvolvimento, pois a maior parte de seu desenvolvimento ocorre fora da mãe. No entanto, a casca de ovo impede o acesso ao embrião para algumas formas de experimentação. Felizmente, os filhotes podem ser incubados fora da concha, ou "ex ovo", usando alguns suprimentos de laboratório comumente disponíveis. Neste vídeo, você aprenderá sobre os princípios da cultura ex ovo, procedimentos passo a passo para dois métodos culturais diferentes e aplicações da técnica em estudos de desenvolvimento.

Antes de falar sobre como criar filhotes ex ovo,vamos passar por cima de alguns princípios da técnica. Dentro do ovo, o filhote desenvolve-se em estreita associação com a membrana vitelline em torno da gema. O volume restante é preenchido com albumina, ou clara de ovo, que protege o embrião e serve como fonte de proteína.

A cultura fora da casca pode ser realizada através de toda a cultura da gema, usando todo o conteúdo do ovo em um recipiente simples. Alternativamente, os tecidos embrionários podem ser excisados e cultivados na cultura ex ovo explant. Ambas as técnicas têm vantagens distintas sobre o uso de ovos com janelas.

Primeiro, a janela de embriões de frango em estágio posterior é complicada devido à presença de muitos vasos sanguíneos cruciais, que se desenvolvem dentro das membranas que circundam o filhote. Isso torna o método ex ovo preferível para trabalhar com filhotes em estágios posteriores.

Em segundo lugar, porque eles podem caber dentro de plataformas de imagem, configurações ex ovo cultura são mais favoráveis a imagens de alta resolução.

Além disso, a remoção de embriões da casca expõe um maior número de tecidos para manipulações experimentais como microcirurgia e microinjeção.

Como o filhote conta com a casca de ovo para proteção e minerais essenciais, a sobrevivência do embrião sem essa estrutura requer alguns cuidados extras. Por exemplo, a habitação deve ser projetada para manter um ambiente estéril e úmido, e os nutrientes devem ser fornecidos na forma de albumina ou meio de cultura. Para a cultura de longo prazo, a casca esmagada também é necessária como fonte de cálcio. Além disso, uma vez que a tensão nas membranas que sustentam o embrião é importante para o desenvolvimento normal, a cultura ex ovo bem sucedida depende também de moradias que mantenham a morfologia da membrana normal.

Agora que você sabe o básico, é hora de se acovardar! Para preparar os ovos para a cultura de ovo de gema inteira, comece incubando-os a 37,5 °C até pouco antes do estágio desejado.

Enquanto espera, prepare a casa. Pratos de petri, barcos de pesagem e redes são comumente usados para segurar o conteúdo do ovo. Primeiro, esterilize todos os componentes por tratamento com luz UV ou etanol.

Além disso, prepare uma câmara externa cheia de água estéril para manter a umidade durante a incubação.

Quando os ovos estiverem prontos, coloque-os em uma posição horizontal por alguns minutos para que o embrião suba até o topo. Em seguida, quebre o fundo da casca e transfira cuidadosamente o conteúdo do ovo para a carcaça. Por fim, cubra o vaso habitacional para manter a umidade e coloque a configuração em uma incubadora até que a idade desejada seja alcançada para o processamento a jusante.

Uma estratégia alternativa ex ovo, cultura explant, requer alguns passos adicionais depois de remover o embrião da casca.

Nesta técnica, a membrana vitelline é suavemente separada da gema, carregando o embrião em desenvolvimento com ela.

Em seguida, a membrana é montada para manter a tensão, o que pode ser feito puxando o tecido apertado em torno de um anel de vidro ou por simples adesão ao papel filtro.

Após a montagem, o meio de cultura é adicionado para cobrir o tecido, e o embrião é colocado em uma câmara umidificada.

Os embriões explantados agora podem ser devolvidos a uma incubadora por até 24 horas de desenvolvimento posterior.

Depois de aprender os princípios e métodos da cultura ex ovo, estamos prontos para alguma peça de aves.

ex cultura ovo é particularmente útil quando você precisa alterar a expressão genética em embriões mais antigos. Uma abordagem para isso é a eletroporação, na qual uma corrente elétrica é usada para permeabilizar membranas celulares para a entrega de material genético. Uma vez que os embriões ex-ovo cultivados também são altamente acessíveis para imagens, a absorção de material genético pode ser facilmente validada através de imagens fluorescentes de embriões inteiros.

Imagens em tempo real da dinâmica celular também são possíveis usando a cultura ex ovo. As células cancerígenas humanas podem formar tumores cooptando vasos sanguíneos da membrana corioallantóica do filhote, ou CAM. Após a formação do tumor, partículas fluorescentes podem ser injetadas diretamente na corrente sanguínea e rastreadas em tempo real. O acúmulo de partículas no tecido tumoral pode ser usado como um indicador de angiogênese, ou a formação de novos vasos sanguíneos.

Embora embriões inteiros possam ser cultivados usando técnicas de explant, alguns experimentos exigem que tecidos embrionários sejam dissecados antes da cultura. Por exemplo, o desenvolvimento de tecido neural pode ser extirpado e cultivado em deslizamentos de tampa de vidro. Após um período de incubação, uma população específica de células conhecidas como crista neural pode ser observada migrando para longe do tecido. O tratamento com agentes experimentais e imagens timelapse podem então ser usados para testar fatores que controlam a migração celular.

Você acabou de ver o guia do JoVE para a cultura de ex-ovo. Este vídeo abordou os princípios da cultura ex ovo, os fundamentos dos métodos de gema e explanto, e algumas das maneiras como essas técnicas são usadas em laboratórios hoje em dia. Obrigado por assistir!

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