Overview
Anche se il genoma umano è stato mappato più di 10 anni fa, gli scienziati sono ancora lontani dal comprendere la funzione di ogni gene umano! Un modo per valutare come funziona un gene è quello di interrompere la sequenza che lo codifica e quindi valutare l'impatto di questo cambiamento (il fenotipo) sulla biologia dell'animale. Questo approccio è comunemente usato nel topo (Mus musculus), poiché condivide un alto grado di somiglianza genetica con gli esseri umani. Per tracciare gli animali che portano cambiamenti genetici nel corso di diverse generazioni, è necessario esaminare il DNA di ciascun topo in un processo noto come genotipizzazione.
Questo video fornisce una panoramica della teoria e della pratica alla base della genotipizzazione dei topi. La discussione inizia con i principi di base della genetica del topo, inclusa una revisione dei termini omozigote, eterozigote, wildtype, mutante e transgenico. Successivamente, vengono fornite istruzioni dettagliate per estrarre e purificare il DNA genomico dal tessuto di topo. Vengono forniti esempi che dimostrano come interpretare i risultati della genotipizzazione e come tenere traccia dei topi con il genotipo desiderato. Infine, verranno presentate alcune applicazioni rappresentative della procedura di genotipizzazione al fine di dimostrare perché questa tecnica comune è così essenziale per la ricerca sui topi.
Procedure
La genotipizzazione è il processo di rilevamento della presenza, o assenza, di specifiche sequenze di DNA nel genoma di un particolare organismo.
Poiché i geni possono influenzare il fenotipo di un topo, essere in grado di sondare il corredo genetico di un singolo topo, o "genotipo", è fondamentale per attribuire un fenotipo a un gene specifico. Questo video esplorerà la genetica del topo, dimostrerà i passaggi chiave della procedura di genotipizzazione e spiegherà come interpretare i risultati della genotipizzazione basata sulla PCR.
Per capire cosa cercano i ricercatori quando genotipino i topi, esaminiamo alcune manipolazioni comuni alla genetica dei topi.
Per studiare un gene, gli scienziati spesso interrompono la sua funzione alterando la sua sequenza genetica. Tuttavia, i topi sono diploidi, quindi hanno due copie di un dato gene. Poiché la maggior parte dei geni ha bisogno di una sola copia normale per funzionare, i topi devono essere allevati per produrre un animale con entrambi i geni interrotti prima di studiare il fenotipo.
Questo genotipo è chiamato "knockout omozigote", o più comunemente solo "knockout" in breve. Al contrario, un topo normale con due copie funzionali è chiamato "wildtype omozigote" o semplicemente "wildtype". Infine, i topi con una sola copia funzionale sono indicati come "eterozigoti" o "hets".
Invece di rimuovere materiale genetico, alcuni esperimenti richiedono l'introduzione di sequenze di DNA nel genoma del topo. Questi frammenti di DNA inseriti sono chiamati "transgeni" e i topi che li trasportano sono "transgenici". Il "transgene" più comune introdotto nei topi è quello che guida l'espressione della proteina fluorescente verde, o GFP, dalle meduse. Utilizzando un promotore tessuto-specifico (una sequenza regolatrice che "promuove" l'attività di un gene) per guidare la produzione di GFP, le cellule di un tipo di tessuto specifico possono essere facilmente identificate dalla fluorescenza verde.
Poiché molti cambiamenti genetici non portano a un fenotipo facilmente osservabile, come l'espressione di GFP, i topi devono essere genotipizzati per determinare quale animale specifico dovrebbe essere usato negli esperimenti. Prima della genotipizzazione, i topi devono essere accuratamente etichettati in modo che possano essere identificati di nuovo in seguito. No, avrai bisogno di qualcosa di più permanente di così. Un metodo comune è quello di fare tacche nell'orecchio, in modo tale che la posizione e il numero di tacche corrispondano a un numero ID.
Una volta che il topo è etichettato, raccogli un piccolo pezzo di tessuto (in genere 2 - 5 mm di coda, usando una lama di rasoio o forbici) da cui estrarre il DNA. Se stai raccogliendo tessuto da più di un topo, contrassegna i segmenti usati della lama per assicurarti di non utilizzare la stessa parte sull'animale successivo, il che potrebbe portare a contaminazione incrociata nei tuoi campioni.
Per iniziare il processo di separazione del materiale genetico da altri componenti del tessuto, il campione viene digerito in un tampone di lisi contenente l'enzima proteinasi K. Dopo una digestione notturna, il campione viene centrifugato per pellettare i capelli e qualsiasi altro materiale non digerito. Per isolare il DNA dal lisato digerito, un metodo semplice ed efficace è quello di aggiungere alcol per precipitare gli acidi nucleici. Dopo una breve incubazione, il campione viene nuovamente centrifugato per raccogliere il DNA in un pellet.
Dopo il lavaggio con etanolo al 70% per rimuovere i sali in eccesso, il pellet di DNA viene risospenato in acqua o tampone ed è pronto per la genotipizzazione.
Ci sono molte strategie per determinare se una specifica sequenza di DNA è presente nei topi. La maggior parte di essi richiede di amplificare prima la regione genetica di interesse utilizzando la reazione a catena della polimerasi o PCR. Per ulteriori informazioni su come impostare la PCR, consultare la "Guida alla PCR" di JoVE Science Education.
Un metodo per distinguere i genotipi è quello di rilevare i cambiamenti nella dimensione del frammento amplificato dalla PCR. Supponiamo che tu stia esaminando i topi con un inserimento genetico di 700 coppie di basi. Dopo la PCR, le bande wildtype sono 200 coppie di basi e le bande transgene dovrebbero essere 900 coppie di basi.
Dopo aver eseguito la PCR, separare i prodotti di reazione su una percentuale appropriata di gel di agarose, in modo da poter distinguere le dimensioni dei frammenti. Il controllo wildtype deve avere solo la banda wildtype a 200 coppie di basi; il controllo transgenico dovrebbe avere solo una coppia di basi 900, banda transgenica; e il controllo het dovrebbe avere entrambe le bande. Infine, è incluso un controllo "no template" per essere sicuri che i reagenti non contengano DNA contaminante e quindi non generino bande.
Ora che siamo sicuri che i controlli hanno funzionato come previsto, diamo un'occhiata ai topi sconosciuti. Poiché i topi 1 e 2 hanno ciascuno una sola banda wildtype, sono wildtype omozigoti. I topi 4 e 6 hanno ciascuno una sola banda transgenica e sono quindi transgenici omozigoti.
E i topi 3 e 5 hanno ciascuno due bande, e sono quindi hets.
Infine, quando torni a trovare i topi con il genotipo che desideri, devi solo abbinare il modello di tacche auricolari con il numero ID del mouse.
Dopo aver acquisito una comprensione di cosa sia la genotipizzazione e di come sia fatta, diamo un'occhiata ad alcuni esempi del perché è utile.
In alcuni casi, sono necessarie modificazioni genetiche più complesse per produrre il fenotipo desiderato. Ad esempio, per stabilire questo modello di cancro della pelle nei topi, sono necessari due transgeni. Uno porta un "oncogene" inducibile, o un gene che può causare il cancro, e il secondo trasporta l'enzima Cre ricombiinasi, che è espresso solo nelle cellule della pelle e asporta una sequenza che impedisce la trascrizione oncogenica, consentendo così l'espressione oncogenica. Per produrre prole con entrambi i transgeni, i topi eterozigoti per ciascuno sono accoppiati. La genotipizzazione viene quindi utilizzata per identificare la prole desiderata.
A volte potrebbe non essere possibile genotipizzare i topi prima di un esperimento. Ad esempio, in questo studio sulla frequenza cardiaca embrionale, non è possibile raccogliere tessuto per la genotipizzazione dagli embrioni senza interrompere il loro comportamento. Pertanto, le posizioni dell'embrione all'interno della madre vengono prima accuratamente etichettate, quindi vengono registrate le misurazioni ecografiche. Infine, vengono raccolte biopsie della coda per determinare l'effetto del genotipo sulla frequenza cardiaca.
Questo video ha dimostrato un metodo di estrazione del DNA, ma ci sono molte varianti. Ad esempio, il sistema Direct PCR richiede meno di cinque minuti di digestione dei tessuti. Inoltre, dopo aver ridotto il materiale non digerito, il surnatante è pronto per la PCR, eliminando la necessità di purificazione del DNA.
Hai appena visto la guida di JoVE alla genotipizzazione dei topi. In questo video, abbiamo esaminato le basi della genetica del topo, come preparare e analizzare campioni di DNA di topo, nonché alcune applicazioni pratiche di questa tecnica. Grazie per l'attenzione!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
