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Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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Overview

Embora o genoma humano tenha sido mapeado há mais de 10 anos, os cientistas ainda estão longe de entender a função de cada gene humano! Uma maneira de avaliar como um gene funciona é interromper a sequência codificando-o e, em seguida, avaliar o impacto dessa mudança (o fenótipo) na biologia do animal. Esta abordagem é comumente usada no camundongo (Mus musculus), uma vez que compartilha um alto grau de semelhança genética com os humanos. Para rastrear os animais com alterações genéticas ao longo de várias gerações, é necessário testar o DNA de cada rato em um processo conhecido como genotipagem.

Este vídeo fornece uma visão geral da teoria e prática por trás de ratos genotipagem. A discussão começa com os princípios básicos da genética do camundongo, incluindo uma revisão dos termos homozigoto, heterozigoto, selvagem, mutante e transgênico. Em seguida, instruções passo a passo são fornecidas para extrair e purificar DNA genômico do tecido do rato. Exemplos são fornecidos demonstrando como interpretar os resultados genotipos, bem como como acompanhar os ratos com o genótipo desejado. Finalmente, algumas aplicações representativas do procedimento de genotipagem serão apresentadas a fim de demonstrar por que essa técnica comum é tão essencial para a pesquisa do rato.

Procedure

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Genotipagem é o processo de detectar a presença, ou ausência, de sequências específicas de DNA no genoma de um determinado organismo.

Uma vez que os genes podem influenciar o fenótipo de um rato, ser capaz de sondar a composição genética de um camundongo individual, ou "genótipo", é fundamental para atribuir um fenótipo a um gene específico. Este vídeo explorará a genética do rato, demonstrará os principais passos do procedimento de genotipagem e explicará como interpretar os resultados de genotipagem baseados em PCR.

Para entender o que os pesquisadores procuram quando genótipos de camundongos, vamos rever algumas manipulações comuns à genética dos camundongos.

Para estudar um gene, os cientistas frequentemente interrompem sua função alterando sua sequência genética. No entanto, os ratos são diploides, então eles têm duas cópias de qualquer gene. Como a maioria dos genes precisa de apenas uma cópia normal para funcionar, os camundongos devem ser criados para produzir um animal com ambos os genes interrompidos antes de estudar fenótipo.

Este genótipo é chamado de "nocaute homozigo", ou mais comumente apenas "nocaute" para abreviar. Por outro lado, um rato normal com duas cópias funcionais é chamado de "tipo selvagem homozigo", ou apenas "tipo selvagem". Finalmente, camundongos com apenas uma cópia funcional são chamados de "heterozigous", ou "hets".

Em vez de remover material genético, alguns experimentos requerem a introdução de sequências de DNA no genoma do camundongo. Esses fragmentos de DNA inseridos são chamados de "transgenes", e os ratos que os carregam são "transgênicos". O "transgene" mais comum introduzido em camundongos é aquele que impulsiona a expressão de proteína fluorescente verde, ou GFP, de águas-vivas. Usando um promotor específico do tecido (uma sequência regulatória que "promove" a atividade de um gene) para impulsionar a produção de GFP, as células de um tipo específico de tecido podem ser facilmente identificadas por fluorescência verde.

Como muitas alterações genéticas não levam a um fenótipo facilmente observável, como a expressão GFP, os camundongos precisam ser genótipos para determinar qual animal específico deve ser usado em experimentos. Antes da genotipagem, os ratos devem ser cuidadosamente rotulados para que possam ser identificados novamente mais tarde. Não, você vai precisar de algo mais permanente do que isso. Um método comum é fazer entalhes no ouvido, de modo que a posição e o número de entalhes correspondem a um número de identificação.

Uma vez que o rato é rotulado, colete um pequeno pedaço de tecido (tipicamente 2 — 5 mm de cauda, usando um razorblade ou uma tesoura) do qual extrair DNA. Se você estiver coletando tecido de mais de um rato, marque os segmentos usados da lâmina para garantir que você não usará a mesma parte no próximo animal, o que pode levar à contaminação cruzada em suas amostras.

Para iniciar o processo de separação do material genético de outros componentes do tecido, a amostra é digerida em tampão de lise contendo a enzima proteinase K. Após uma digestão durante a noite, a amostra é centrifuada para pelo de pelotas e qualquer outro material não digerido. Para isolar o DNA do lisato digerido, um método simples e eficaz é adicionar álcool a ácidos nucleicos precipitados. Após uma breve incubação, a amostra é centrifuga novamente para coletar o DNA em uma pelota.

Depois de lavar com 70% de etanol para remover o excesso de sais, a pelota de DNA é resuspendida em água ou tampão e está pronta para genotipagem.

Existem muitas estratégias para determinar se uma sequência específica de DNA está presente em seus camundongos. A maioria deles exige que você primeiro amplie a região genética de interesse usando a reação em cadeia de polimerase, ou PCR. Para obter mais informações sobre como configurar o PCR, confira o "Guia para PCR" da JoVE Science Education.

Um método para distinguir genótipos é detectar alterações no tamanho do fragmento amplificado pelo PCR. Digamos que você está rastreando para ratos com uma inserção genética de 700 pares de bases. Depois do PCR, as bandas wildtype são 200 pares de base, e as bandas transgene devem ser 900 pares de base.

Depois de executar seu PCR, separe os produtos de reação em um gel de agarose percentual apropriado, para que você possa distinguir os tamanhos de seus fragmentos. O controle do tipo selvagem deve ter apenas a banda wildtype de 200 pares base; o controle transgênico deve ter apenas um par de base 900, banda transgênica; e o controle het deve ter ambas as bandas. Finalmente, um controle "sem modelo" está incluído para ter certeza de que os reagentes não contêm dna contaminante e, portanto, não devem gerar nenhuma faixa.

Agora que estamos confiantes de que os controles funcionaram como esperado, vamos verificar os ratos desconhecidos. Uma vez que os ratos 1 e 2 cada um tem apenas uma banda, wildtype, eles são homozygous wildtype. Os ratos 4 e 6 têm apenas uma banda transgênica, e, portanto, são transgênicos homozigosos.

E os ratos 3 e 5 cada têm duas bandas, e são, portanto, hets.

Finalmente, quando você volta para encontrar os ratos com o genótipo que você deseja, você só precisa combinar o padrão de entalhes de ouvido com o número de identificação do mouse.

Depois de obter uma compreensão do que é genotipagem e como é feito, vamos olhar para alguns exemplos de por que é útil.

Em alguns casos, modificações genéticas mais complexas são necessárias para produzir o fenótipo desejado. Por exemplo, para estabelecer esse modelo de câncer de pele em camundongos, são necessários dois transgenes. Um carrega um "oncogene" indutível, ou um gene que pode causar câncer, e o segundo carrega a enzima Cre recombinase, que só é expressa em células da pele e excisa uma sequência que impede a transcrição oncogênica, permitindo assim a expressão oncogene. Para produzir descendentes com ambos transgênicos, ratos heterozigos para cada um são acasalados. Genotipagem é então usada para identificar a prole desejada.

Às vezes pode não ser possível genótipo de ratos antes de um experimento. Por exemplo, neste estudo da frequência cardíaca embrionária, não é viável coletar tecido para genotipagem dos embriões sem interromper seu comportamento. Portanto, as posições de embrião dentro da mãe são primeiro cuidadosamente rotuladas, em seguida, as medidas de ultrassom são registradas. Finalmente, biópsias de cauda são coletadas para determinar o efeito do genótipo na frequência cardíaca.

Este vídeo demonstrou um método de extração de DNA, mas há muitas variações. Por exemplo, o sistema DIRECT PCR requer menos de cinco minutos de digestão tecidual. Além disso, depois de girar para baixo material não digerido, o supernante está pronto para PCR, eliminando a necessidade de purificação de DNA.

Você acabou de ver o guia do JoVE para genotipar ratos. Neste vídeo, revisamos o básico da genética do camundongo, como preparar e analisar amostras de DNA do rato, bem como algumas aplicações práticas desta técnica. Obrigado por assistir!

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