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Patch Clamp Elettrofisiologia

Overview

Le membrane cellulari dei neuroni sono popolate da canali ionici che controllano il movimento della carica dentro e fuori la cellula, regolando così il fuoco dei neuroni. Una tecnica estremamente utile per studiare le proprietà biofisiche di questi canali è chiamata patch clamp recording. In questo metodo, i neuroscienziati posizionano una micropipetta di vetro lucido contro una cellula e applicano l'aspirazione per formare un sigillo ad alta resistenza. Questo processo isola una piccola "patch" di membrana che contiene uno o più canali ionici. Utilizzando un elettrodo all'interno della micropipetta, i ricercatori possono "bloccare" o controllare le proprietà elettriche della membrana, che è importante per l'analisi dell'attività del canale. L'elettrodo consente inoltre di registrare i cambiamenti nella tensione attraverso la membrana o il flusso di ioni attraverso la membrana.

Questo video inizia con una panoramica dei principi alla base dell'elettrofisiologia del patch clamp, un'introduzione alle attrezzature necessarie e descrizioni delle varie configurazioni di patch, tra cui patch a cellula intera, collegate a cellule, perforate, inside-out ed outside-out. Successivamente, vengono delineati i passaggi chiave di un tipico esperimento di patch clamp a cella intera, in cui viene generata una curva corrente-tensione (IV). Infine, vengono fornite applicazioni di registrazione del patch clamp per dimostrare come le proprietà biofisiche dei canali ionici, l'eccitabilità cellulare e i composti neuroattivi siano valutate oggi nei laboratori di neurofisiologia.

Procedure

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La registrazione del patch clamp è una tecnica estremamente utile per studiare le proprietà biofisiche dei canali ionici che controllano l'attivazione neuronale.

La procedura prevede la pressione di una micropipetta di vetro contro una cellula al fine di isolare una piccola "patch" di membrana che contiene uno o più canali ionici.

La configurazione sperimentale consente inoltre agli scienziati di "bloccare" l'ambiente elettrico dell'area rattoppata controllando con precisione la tensione attraverso la membrana cellulare, che, a seconda dei canali ionici presenti, influisce sul flusso di ioni attraverso la membrana e consente uno studio complesso di questi canali.

Questo video presenta una panoramica dei principi alla base della tecnica del patch clamp, una descrizione dei passaggi necessari per eseguire un esperimento e, infine, alcune delle applicazioni di questo metodo.

Innanzitutto, esaminiamo i principi alla base della registrazione del morsetto patch.

Il numero di ioni positivi e caricati negativamente all'interno di un neurone differisce dal numero trovato all'esterno.

Questo squilibrio produce una differenza di tensione, o potenziale di membrana, di circa -70 mV, il che significa che l'interno è più negativo dell'esterno.

I canali ionici aiutano a mantenere il gradiente controllando il movimento degli ioni attraverso la membrana cellulare, che sono essenzialmente correnti elettriche.

Utilizzando la tecnica del patch clamp, gli scienziati pongono domande sulla natura del potenziale e della corrente.

Il patch clamp rig include una micropipetta di vetro, che contiene sia una soluzione ionica che un elettrodo di argento clorurato per misurare tensioni e correnti.

La punta della micropipetta ha un'apertura lucida di un micron che racchiude una piccola area di membrana.

Per eliminare il rumore di fondo dagli ioni all'interno della soluzione del bagno, si forma una guarnizione ad alta resistenza tra la pipetta e la patch a membrana. Poiché la resistenza del sigillo è nell'intervallo gigaohm, è noto come sigillo gigaohm.

L'elettrodo all'interno della pipetta è collegato a un amplificatore in grado di amplificare le fluttuazioni di corrente e tensione che sono il risultato del movimento degli ioni attraverso i canali nella membrana plasmatica.

Con l'amplificatore, gli scienziati possono bloccare o impostare artificialmente il potenziale di membrana a tensioni specifiche.

L'amplificatore regola quanta corrente deve essere aggiunta attraverso l'elettrodo d'argento per mantenere costante la tensione.

Poiché diversi canali ionici voltaggio-dipendenti si aprono a tensioni specifiche, gli eventi di apertura sono rappresentati dalle variazioni nei profili delle correnti misurate.

In alternativa, gli scienziati possono forzare una corrente specifica attraverso l'elettrodo e registrare i cambiamenti di potenziale risultanti. In questa configurazione "morsetto corrente" è possibile registrare i potenziali d'azione.

Diamo ora un'occhiata ai cinque principali tipi di configurazioni patch clamp.

Il primo è la configurazione collegata alla cellula in cui la micropipetta è semplicemente sigillata alla membrana di una cellula intatta.

Il secondo è la configurazione dell'intera cellula in cui la membrana all'interno della micropipetta viene rotta per fornire l'accesso all'interno della cellula.

Il terzo è la configurazione della patch perforata. Qui, sostanze chimiche come gli antibiotici vengono aggiunte alla micropipetta per fare piccoli fori nella membrana che forniscono l'accesso al citosol.

La quarta configurazione è la patch inside-out. Per raggiungere questo obiettivo, la micropipetta forma prima un sigillo con la cella, quindi viene tirata indietro rapidamente, strappando un pezzo della membrana ed esponendo la superficie interna alla soluzione del bagno.

Ciò consente di esporre il lato citoplasmatico dei canali a diverse sostanze chimiche applicate al bagno.

Infine, simile a inside-out, la patch outside-out inizia come una configurazione a cella intera. La micropipetta viene lentamente prelevata fino a quando un pezzo di membrana forma un sigillo convesso attraverso la punta.

In questa configurazione, la faccia extracellulare del canale può essere esposta a trattamenti sperimentali.

Ora che abbiamo esaminato i principi, esaminiamo i passaggi richiesti per eseguire una registrazione patch clamp.

Inizia tirando un tubo di vetro borosilicato in micropipette usando un estrattore di pipette.

Quindi, lucidare a fuoco la punta per ottenere il diametro e la resistenza appropriati.

Dopo la lucidatura, riempire la micropipetta con una soluzione ionica e scorrere delicatamente per rimuovere eventuali bolle d'aria.

Quindi far scorrere la micropipetta sull'elettrodo collegato a un supporto.

Una volta fissato, utilizzare una siringa per applicare una pressione positiva alla pipetta, che impedisce ad altre soluzioni di entrare nella punta.

Ora, posiziona le tue cellule o il tessuto di interesse sullo stadio del microscopio e sposta la micropipetta verso una cellula.

Con l'amplificatore che genera impulsi di tensione di prova, registrare la resistenza, che aumenterà una volta che la punta tocca la cella.

Per formare il sigillo gigaohm, passare delicatamente dalla pressione positiva a quella negativa usando la siringa. La formazione del sigillo comporterà un rapido aumento della resistenza a più di 1 gigaohm.

Ora che è stata stabilita una configurazione collegata alla cella, convertiamo in una configurazione a cella intera e facciamo un esperimento!

Ricordiamo che una configurazione a cellula intera è quando la membrana è rotta.

La rottura si ottiene aggiungendo una pressione negativa alla micropipetta.

Una volta che la membrana si rompe, la forma dell'impulso di prova avrà grandi transitori di corrente, poiché la membrana cellulare ora agisce come un condensatore, che viene caricato dall'impulso di prova.

Le proprietà di un singolo tipo di canale ionico in un dato neurone possono essere studiate bloccando farmacologicamente l'attività di altri tipi di canali.

Un protocollo a passo di tensione viene utilizzato per esaminare le correnti del canale ionico evocate facendo passare la tensione a una serie di diversi potenziali di tenuta.

La curva corrente-tensione o IV mostra le dipendenze di tensione della corrente che scorre attraverso un canale ionico e fornisce informazioni su quali tensioni il canale è aperto o chiuso.

Diamo ora un'occhiata ad alcune applicazioni per esplorare cosa possono fare i neuroscienziati con questa tecnica.

A volte, i canali ionici presenti nei neuroni possono essere studiati in un ambiente non cellulare.

Qui gli scienziati hanno aggiunto proteine dei canali ionici a una membrana lipidica artificiale per studiare quei canali in isolamento.

Questi canali possono quindi essere esposti a molecole sperimentali, come la capsaicina derivata dal peperoncino, per studiare il loro impatto sull'attività del canale.

Poiché sono esposti all'ambiente extracellulare e hanno un impatto significativo sulla funzione cellulare, i canali ionici sono eccellenti bersagli farmacologici. Quando i composti di prova vengono aggiunti alla micropipetta o alle soluzioni da bagno, le registrazioni del morsetto del cerotto possono essere utilizzate per testare direttamente l'effetto di farmaci, come la nicotina, sull'attività neurale. Il principio di applicare una pressione negativa per formare un sigillo ad alta resistenza è stato persino applicato per costruire dispositivi ad alta produttività, in grado di registrare da numerose cellule contemporaneamente per applicazioni di screening farmacologico.

Il patch clamp a cellule intere è uno strumento prezioso per misurare la risposta delle singole cellule agli stimoli.

Inoltre, le registrazioni accoppiate possono essere utilizzate per studiare l'impatto del fuoco dei neuroni sulle cellule bersaglio eccitabili, come i muscoli. In questo esempio, il morsetto patch a cellule intere viene utilizzato per stimolare l'attivazione di un motoneurone, mentre le registrazioni vengono simultaneamente prelevate dalla fibra muscolare che controlla. Si osservano chiare relazioni tra eccitazione neuronale e attività muscolare.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla registrazione del patch clamp in cui sono stati esaminati i principi alla base della tecnica e le fasi di esecuzione di un esperimento.

Con la sua squisita sensibilità temporale ai cambiamenti di tensione e correnti, la registrazione del patch clamp continuerà ad essere strumentale nella comprensione della biofisica dei canali e dei neuroni.

Grazie per l'attenzione!

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