Overview
יוני סידן ממלאים תפקיד אינטגרלי בתפקוד הנוירון: הם פועלים כאותות תאיים שיכולים לעורר תגובות כגון ביטוי גנים שונה ושחרור נוירוטרנסמיטר של שלטים סינפטיים. בתוך התא, ריכוז הסידן הוא דינמי מאוד בשל נוכחות של משאבות כי באופן סלקטיבי להעביר יונים אלה בתגובה למגוון של אותות. הדמיית סידן מנצלת את שטף הסידן התאי כדי לדמיין באופן ישיר את איתות הסידן בתאי עצב חיים.
וידאו זה מתחיל עם סקירה של ריאגנטים מפתח המשמשים עבור טכניקה זו, המכונה צבעי מחוון סידן. הדיון כולל מבוא לצבע הנפוץ Fura-2 וכמה עקרונות בסיסיים מאחורי האופן שבו פועלים אינדיקטורים רציטריים ולא-יחסטריים לסידן. לאחר מכן, מוצג ניסוי הדמיית סידן טיפוסי, החל מהכנת התאים והצבע ועד לכידה וניתוח של תמונות פלואורסצנטיות. לבסוף, מספר יישומים ניסיוניים של הדמיית סידן מסופקים, כגון חקר פעילות רשת עצבית ועיבוד חושי.
Procedure
דימות סידן הוא טכניקה שימושית ביותר לחקור את מגוון התפקידים שיש ליוני סידן בנוירונים מתפקדים. יוני סידן ליצור שפע של אותות תאיים השולטים פונקציות מפתח, כגון שחרור נוירוטרנסמיטר של שלל סינפטי. שיטות הדמיית סידן מאפשרות מדידה ישירה של שטף הסידן הדינמי בתוך נוירונים ורקמות עצביות. וידאו זה מספק סקירה של אופן הפעולה של צבעי חיווי סידן, כיצד ניסוי הדמיית סידן הושלם, ולבסוף דן בחלק מהיישומים של טכניקה זו.
ראשית, בואו נסקור את העקרונות הביוכימיים של צבעי אינדיקטור סידן.
צבעי חיווי סידן הם מולקולות כלאטור מותאמות, כגון Fura-2, המורכבות משני מרכיבים עיקריים. הראשון הוא אתר הכלטור שקושר סידן בצורה סלקטיבית. השני הוא אתר פלואורסצנטי הפולט אור אורך גל מסוים כאשר הוא מואר על ידי אורך גל עירור של אור אולטרה סגול.
כריכת הסידן לצבע משנה את תכונות הפלואורסצנטיות שלו, המספקת דרך לכמת את השינויים בריכוז הסידן, המיוצג כאן על ידי ההבדל בעוצמה פלואורסצנטית הנפלטת על ידי נוירון זה בשני אורכי גל עירור שונים.
רוב צבעי חיווי הסידן משתנים עוד יותר כדי לאפשר להם לחצות בקלות את קרום התא והם מוצגים או בתמיסת האמבטיה עם הנוירונים או מוזרק לתוך רקמת המוח למחקרים של בעלי חיים שלמים.
צבעים מסוימים יש עירור כפול או תכונות פליטה כפולה תלוי אם סידן קשור או לא. קח, למשל, את צבע Fura-2, אשר יש אורך גל עירור שונה כאשר סידן קשור לעומת כאשר הוא לא. על ידי לקיחת היחס של עוצמת הפליטה בשני אורכי הגל עירור, הערכה הרבה יותר מדויקת של ריכוז סידן יכול להיעשות.
צבע עירור או פליטה כפול, כמו Fura-2, נקראים אינדיקטורים סידן יחסטרי. צבעים לא-יחסטריים בעלי עירור יחיד ואורכי גל פליטה קיימים. עם זאת, הם רגישים יותר להלבנה פוטו, אשר נחלשת או אובדן פלואורסצנטיות עם חשיפה ממושכת לאור.
צעד מפתח לפני השימוש בצבע בניסוי הוא לכייל את מדידות הפלואורסצנטיות שנלקחו מהצבע עם פתרונות של ריכוזי סידן ידועים. זה יאפשר למדענים להעריך במדויק ריכוזי סידן תאיים בהתבסס על עוצמות פליטה נמדדות במהלך ניסויים.
עכשיו כשלמדנו איך אינדיקטורים לסידן עובדים, בואו נחקור איך לדמיין שטף סידן בנוירונים מצופים.
התחל על ידי הכנת צבע אינדיקטור סידן של בחירה, כגון Fura-2, וערבוב אותו עם פתרונות פיזיולוגיים נוספים. מערבולת הפתרון כדי להבטיח ערבוב נכון. פעם מעורבבים מספיק מעבירים לצלחת. עכשיו למקם את הפתק כיסוי עם נוירונים מתורבתים בצלחת עם פתרון צבע. לאחר מכן, לדגור על הנוירונים בחושך לזמן הנדרש בטמפרטורה המתאימה, אשר במקרה זה הוא 30 דקות ב 37 °C (50 °F). לאחר תקופת הדגירה, מעבירים את הכיסוי לצלחת ללא הצבע.
השלב הבא הוא לעלות את כיסוי על תא ההדמיה של המיקרוסקופ. לאחר הטעינה, חבר את קו הקלט של מערכת הזילוף ומלא לאט את התא. אבטחו את התא לשלב המיקרוסקופ והתקינו את קווי הפלט, מה שמבטיח זרימה רציפה בכל מערכת ההשתנות.
עכשיו, כאשר שלב המיקרוסקופ מוכן, להביא את הנוירונים לפוקוס באמצעות אור נראה. בדוק את הצבע על ידי הארת התאים באורכי גל של 340 ו- 380 ננומטר. זכור כי עם Fura-2, נוירונים לא מופעלים צריך לפלוט יותר אור כאשר נרגש על ידי 380 ננומטר מאז סידן אינו מאוגד.
לאחר מכן, התאם את הגדרות המצלמה כדי למטב את הטווח הדינמי לפני תחילת הניסוי. אסוף תמונה בכל אורך גל ולאחר מכן השתמש באזור העניין או בכלי ROI כדי למדוד את עוצמת הרקע בכל אורך גל. הזן את ערכי הרקע בתוכנת הבקרה כך שניתן יהיה להחסירם מהתמונות הבאות.
לאחר השלמת ההתקנה הראשונית, בחר את חמשת שדות הראייה שיש לדמיין עבור הניסוי ולשמור את הקואורדינטות בתוכנת הבקרה. במהלך הניסוי השלב האוטומטי עובר לשדה, אוסף יחס של עוצמת השדה באורכי גל של 340 ו-380 ננומטר, ועובר לשדה הבא עד שכל השדות נאספים.
בניסויים מסוימים, סוכן פרמקולוגי מתווסף לנוזל זלוף שגורם לשינויים ברמות הסידן התאי. פתרון אשלגן גבוה, אשר depolarizes נוירונים, יכול לגרום ריכוז סידן תאי לעלות כפי שמוצג הפעם לשגות בסדרה של תמונות ומשמש שליטה חיובית טובה. לאחר השלמת איסוף הנתונים, המשך לניתוח.
כדי לנתח את התוצאות, בחר אזורים מעניינים הכוללים נוירונים או חלקים של נוירונים באמצעות התוכנה. לאחר מכן, השתמש בתוכנה כדי למדוד מידע בעוצמה יחסית של תמונה משני אורכי הגל בכל ROI בכל התמונות שנאספו. עם מידע זה, הערכה כמותית של השינויים בריכוזים סידן תאי לאורך זמן ניתן לבצע.
עכשיו שיש לכם הבנה של האופן שבו מושגת הדמיית סידן בנוירונים, בואו נסתכל על כמה מהדרכים שבהן שיטה חשובה זו מיושמת במחקר היום.
בראש ובראשונה, הדמיית סידן משמשת כדי לחקור כיצד סידן תאיים שטף ביחס לפעילות עצבית.
במחקר זה, נוירונים בודדים היו מלאים צבע אינדיקטור סידן תוך כדי מהדק תיקון נרשם. השליטה המדויקת בפוטנציאל הממברנה המתאפשר על ידי טכניקת מהדק התיקון מספקת תובנה על דינמיקת שטף הסידן.
הדמיית סידן מאפשרת לחוקרים לחקור את פעילות הרשת הסינכרונית ביותר של נוירונים.
כאן, מדעני מוח השתמשו בהדמיית סידן כדי להעריך את האות הפלואורסצנטי של 40 נוירונים. עם מידע זה, ניתן לקבוע מאפייני רשת כגון התפשטות אותות ומתאם עצבי.
דינמיקת סידן יכולה גם לחשוף כיצד נוירונים מעבדים אותות מהעולם החיצון, כמו ריחות.
בניסוי זה, איברים חישת פרומון שחולצו מאף העכבר גדלו בתרבות. נוירונים בתוך הרקמה היו דגירה עם Fura-2 ותמונה תוך הצגת ריחות כמו שתן או פרומונים מטוהרים. על ידי מניפולציה הביטוי של חלבוני קולטן ריח בנוירונים חוש הריח, ניתן לדמיין באופן ישיר כיצד חלבון יחיד משפיע על היכולת של תא להגיב ריחות ייחודיים.
הרגע צפית בהקדמה של JoVE להדמיית סידן בנוירונים. בסרטון זה דנו במאפיינים שמאחורי הטכניקה וסקרנו ניסוי טיפוסי.
בהתחשב בתפקידים החשובים הרבים של סידן, הדמיית סידן תישאר כלי חיוני בהבנת הנוירונים וכיצד הם מתקשרים זה עם זה.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
