Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

뉴런의 칼슘 이미징

Overview

칼슘 이온은 신경 기능에 필수적인 역할을합니다: 그(것)들은 시냅스 소포에서 변경한 유전자 발현 및 신경 전달물질 방출과 같은 반응을 유도할 수 있는 세포내 신호로 작동합니다. 세포 내에서 칼슘 농도는 다양한 신호에 반응하여 이러한 이온을 선택적으로 운반하는 펌프의 존재로 인해 매우 역동적입니다. 칼슘 이미징은 세포내 칼슘 플럭스를 활용하여 살아있는 뉴런에서 칼슘 신호를 직접 시각화합니다.

이 비디오는 칼슘 표시기 염료로 알려진이 기술에 사용되는 주요 시약의 개요로 시작됩니다. 토론에는 일반적으로 사용되는 염료 Fura-2에 대한 소개와 비비율 칼슘 지표가 어떻게 작동하는지 에 대한 몇 가지 기본 원칙이 포함됩니다. 다음으로, 세포와 염료를 준비하는 것에서부터 형광 이미지를 캡처하고 분석하는 것에 이르기까지 전형적인 칼슘 이미징 실험이 제시됩니다. 마지막으로, 칼슘 이미징의 여러 실험 응용 프로그램이 제공, 신경 네트워크 활동 및 감각 처리의 연구와 같은.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

칼슘 이미징은 칼슘 이온이 신경 을 작동하는 다양한 역할을 조사하는 데 매우 유용한 기술입니다. 칼슘 이온은 시냅스 소포에서 방출되는 신경 전달물질 방출과 같은 주요 기능을 제어하는 세포 내 신호를 많이 생성합니다. 칼슘 이미징 방법은 뉴런 및 뉴런 조직 내에서 동적 칼슘 플럭스를 직접 측정할 수 있습니다. 이 비디오는 칼슘 표시기 염료가 어떻게 작동하는지, 칼슘 이미징 실험이 어떻게 완료되는지에 대한 개요를 제공하며, 마지막으로이 기술의 응용 분야에 대해 설명합니다.

먼저 칼슘 표시기 염료의 생화학 적 원리를 검토해 보겠습니다.

칼슘 표시기 염료는 두 가지 주요 구성 요소로 구성된 후라-2와 같은 변형된 첼라기 분자입니다. 첫 번째는 선택적 방법으로 칼슘을 묶는 첼레이터 사이트입니다. 두 번째는 자외선의 난사 파장에 의해 조명될 때 특정 파장에서 빛을 방출하는 형광 부위입니다.

염료에 칼슘의 결합은 두 개의 다른 흥분 파장에서 이 뉴런에 의해 방출되는 형광 강도의 차이로 대표되는 칼슘 농도의 변화를 정량화하는 방법을 제공하는 형광 특성을 변화시다.

대부분의 칼슘 표시기 염료는 세포막을 쉽게 교차할 수 있도록 추가로 수정되며 뉴런이 있는 목욕 용액에 도입되거나 전체 동물 연구를 위해 뇌 조직에 주입됩니다.

일부 염료는 칼슘이 결합되어 있는지 여부에 따라 이중 여기 또는 이중 방출 특성을 가지고 있습니다. 예를 들어, 칼슘이 구속될 때 와 다른 흥분 파장을 가지는 염료 후라-2를 예로 들 수 있습니다. 두 개의 여기 파장에서 배출 강도의 비율을 취함으로써 칼슘 농도의 훨씬 더 정확한 추정을 할 수 있습니다.

후라-2와 같은 이중 여기 또는 방출 염료는 비율 측정 칼슘 지표라고합니다. 단일 여기 및 방출 파장이 있는 비비율 염료가 존재합니다. 그러나, 그(것)들은 장시간 광 노출을 가진 형광의 약화 또는 손실인 광표백에 더 취약합니다.

실험에서 염료를 사용하기 전에 중요한 단계는 알려진 칼슘 농도의 용액으로 염료에서 가져온 형광 측정을 보정하는 것입니다. 이를 통해 과학자들은 실험 중 측정된 방출 강도를 기반으로 세포내 칼슘 농도를 정확하게 추정할 수 있습니다.

칼슘 지표가 어떻게 작동하는지 배웠으니, 도금된 뉴런에서 칼슘 플럭스를 이미지화하는 방법을 살펴보겠습니다.

먼저 후라-2와 같은 선택의 칼슘 지표 염료를 준비하고 추가 생리적 용액과 혼합합니다. 적절한 혼합을 보장하기 위해 솔루션을 소용돌이. 일단 충분히 혼합 된 요리로 전송합니다. 이제 염료 용액을 가진 접시에 배양 된 뉴런으로 커버 슬립을 놓습니다. 다음으로, 적절한 온도에서 필요한 시간 동안 어둠 속에서 뉴런을 배양하고, 이 경우 37°C에서 30분이다. 인큐베이션 기간 이후에는 염료없이 접시에 커버 슬립을 옮김하십시오.

다음 단계는 현미경의 이미징 챔버에 커버 슬립을 장착하는 것입니다. 일단 장착되면 관류 시스템의 입력 라인을 연결하고 천천히 챔버를 채웁니다. 현미경 단계에 챔버를 확보하고 출력 관류 라인을 설치하여 관류 시스템 전반에 걸쳐 지속적인 흐름을 보장합니다.

이제 현미경 단계가 준비되었으므로 가시광선을 사용하여 뉴런을 초점으로 가져 오십시오. 340 nm 파장에서 세포를 조명하여 염료를 테스트합니다. Fura-2를 사용하면 칼슘이 결합되지 않기 때문에 380 nm에 흥분하면 더 많은 빛을 방출해야한다는 것을 기억하십시오.

다음으로 실험을 시작하기 전에 동적 범위를 최적화하기 위해 카메라 설정을 조정합니다. 각 파장에서 이미지를 수집한 다음 관심 영역 또는 ROI 도구를 사용하여 각 파장의 배경 강도를 측정합니다. 배경 값을 제어 소프트웨어에 입력하여 후속 이미지에서 빼길 수 있습니다.

초기 설정이 완료되면 실험을 위해 이미지를 이미지와 컨트롤 소프트웨어에 좌표를 저장할 뷰 의 5개 정도의 필드를 선택합니다. 실험 중에 자동화된 스테이지는 필드로 이동하고, 340 nm 파장의 필드 강도 비율을 수집하고, 모든 필드가 수집될 때까지 다음 필드로 이동한다.

일부 실험에서, 약리학 에이전트는 세포내 칼슘 수준에 있는 변경을 일으키는 원인이 되는 관류 액체에 추가됩니다. 뉴런을 탈극화하는 높은 칼륨 용액은 이 시간 경과 시리즈에 도시된 바와 같이 세포내 칼슘 농도가 상승하도록 유발할 수 있으며 양수 조절역할을 합니다. 데이터 수집이 완료되면 분석을 진행합니다.

결과를 분석하려면 소프트웨어를 사용하여 뉴런 또는 뉴런의 일부를 포함하는 관심 영역을 선택합니다. 다음으로, 소프트웨어를 사용하여 수집된 모든 이미지에서 각 ROI의 두 파장의 이미지 비율 측정 강도 정보를 측정합니다. 이 정보를 통해 시간이 지남에 따라 세포 내 칼슘 농도의 변화에 대한 정량적 평가를 할 수 있습니다.

뉴런에서 칼슘 이미징이 어떻게 이루어지는지 이해하게 되었으므로 오늘날 연구에서 이 귀중한 방법이 어떻게 적용되는지 살펴보겠습니다.

무엇보다도 칼슘 이미징은 세포내 칼슘이 신경 활동과 관련하여 어떻게 변속되는지 조사하는 데 사용됩니다.

이 연구에서는, 개별 뉴런은 패치 클램프기록되는 동안 칼슘 지표 염료로 채워졌다. 패치 클램프 기술로 구현된 멤브레인 전위를 정밀하게 제어하면 칼슘 플럭스 역학에 대한 통찰력을 제공합니다.

칼슘 이미징을 통해 연구자들은 뉴런의 매우 동기적인 네트워크 활동을 조사할 수 있습니다.

여기서 신경 과학자들은 칼슘 이미징을 사용하여 40개의 뉴런의 형광 신호를 평가했습니다. 이 정보를 사용하면 신호 전파 및 신경 상관 관계와 같은 네트워크 속성을 확인할 수 있습니다.

칼슘 역학은 또한 뉴런이 냄새와 같은 외부 세계의 신호를 처리하는 방법을 밝힐 수 있습니다.

이 실험에서는 마우스 코에서 추출한 페로몬 감지 기관이 배양에서 성장하였다. 조직 내의 뉴런은 Fura-2로 배양되었고 소변이나 정제 된 페로몬과 같은 냄새물질을 제시하면서 이미지화되었습니다. 후각 뉴런에서 악취 수용체 단백질의 발현을 조작함으로써, 단일 단백질이 독특한 냄새에 반응하는 세포의 능력에 어떻게 영향을 미치는지 직접 시각화할 수 있다.

당신은 단지 뉴런에서 칼슘 이미징에 JoVE의 소개를 보았다. 이 비디오에서는 기술의 뒤에 있는 속성에 대해 논의하고 일반적인 실험을 검토했습니다.

칼슘의 많은 중요한 역할을 감안할 때, 칼슘 화상 진찰은 뉴런의 이해와 상호 작용하는 방법에 있는 중요한 공구로 남아 있을 것입니다.

시청해 주셔서 감사합니다!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter