כתמים היסתולוגיים של רקמה עצבית

פרוסות, או חלקים, של רקמת המוח הם חומר עשיר לחקר המבנה והתפקוד של המוח. עם זאת, מוח לא מטופל הוא רקמה אחידה מבחינה חזותית, כמו בד ריק. הכתמתם היא דרך "לצייר" את המוח כדי לדמיין בבירור את הרכיבים התאיים, המבניים והמולקולריים של האיבר. בעוד שרוב הכתמים חולקים שיטות היסתולוגיות נפוצות, לכל גישה יש מטרה מורפולוגית ייחודית. וידאו זה יספק קו מתאר של העקרונות הכלליים של היסתולוגיה במוח, להדגים כמה טכניקות הכתמה נפוצות, ולסקור כמה יישומים של שיטות אלה במעבדות מדעי המוח היום.

לפני דיון כיצד הליכי הכתמה נוירולוגית מתבצעים, מאפשר לסקור את המטרות של טכניקות אלה.

כתמים היסתולוגיים משמשים בדרך כלל כדי לספק ניגודיות, ובכך לחשוף תכונות שלא ניתן להבחין רקמה נגועה. לדוגמה, כדי לדמיין את גופי תאי הנוירון, או סומטה, המרכיבים את החומר האפור של מערכת העצבים, כתמים מרובים זמינים. הצבעים המשמשים כתמי Nissl לצרף חומצות גרעין, צביעת סומטה סגול וארגון עצבי חושפני.

לחלופין, כדי להסתכל על חומר לבן, אתה יכול להכתים מיאלין - נדן חומצת השומן סביב אקסונים - עם צבעים כמו Luxol מהיר כחול. לחלופין, כתמים אימונוהיסטוכימיים יכולים להדגיש מטרות מולקולריות שנמצאו בסוגי תאים ספציפיים. טכניקה זו מנצלת את הספציפיות בין נוגדנים לבין מטרות מולקולריות המכונות אנטיגנים. השימוש בנוגדנים המותכים לאנזימים או לתרכובות פלואורסצנטיות מאפשר לחוקרים לדמיין את אתרי הכריכה שלהם באמצעות תגובות אנזימטיות או פלואורסצנטיות.

כעת, לאחר שהוצגו בפניכם הרעיון של מקטעי הכתמה, בואו נבחן את הצעדים ההטולוגיים הנפוצים שקדמו להכתמת רקמת המוח ויבטיחו תנאים אופטימליים להדמיה.

כדי לשמר את מבנה הרקמות, המוח מנוטרל תחילה - כלומר הדם מנוקז מהמוח ו vasculature של החיה משמש כדי לספק קיבוע כימי. לאחר הניתוח, המוח שקוע לחלוטין בקבע כדי להשלים את תהליך השימור.

לאחר מכן, הדגימה מוטבעת במדיום עם תכונות מכניות דומות לרקמת המוח, כמו שעוות פרפין. לאחר ההטבעה, המוח הוא חתך דק באמצעות מכשיר המכונה microtome. לאחר מכן, הפרוסות מותקנות על שקופיות ומותר להן להתייבש.

מכיוון שרוב הצבעים מבוססים על מים, יש לסלק את הרקמה ולהידר מחדש לפני שניתן יהיה להתחיל בכתמים. כדי להשיג זאת, השקופיות נשטפות בקסילן כדי להמיס את השעווה לפני rehydration הדרגתי באמצעות סדרה של אתנול מדולל יותר ויותר. תהליך זה צריך להתבצע במכסה אדים תוך כדי לבישת ציוד המגן האישי המתאים.

לאחר הכנת רקמת המוח שלך, אתה מוכן עכשיו להתחיל את הליך הכתמים.

השלב הראשון, המכונה חסימה, מפחית כתמי רקע הנגרמים על ידי כריכת נוגדנים לא-מדעיים. חשיפת המקטע לסרום משיגה זאת על ידי החדרת נוגדנים ללא תווית שנקשרים לאתרים שאינם מטרות. לאחר חסימה של 30 דקות עד לילה, הרקמה מוכנה לדגירה עם נוגדן ראשוני, אשר נקשר למטרות מולקולריות ספציפיות.

נוגדנים מדוללים בדרך כלל בתמיסת חסימה המכילה חומר ניקוי, אשר משבש את קרום התא ומאפשר לנוגדנים להיכנס לציטופלזמה.

לאחר דגירה לילית, נוגדנים ראשוניים עודפים מוסרים על ידי שטיפות קצרות במאגר. לאחר מכן, הנוגדנים המשניים, מצומדים לאנזימים או פלואורופורים, מוצגים כדי לתייג באופן ספציפי את הנוגדנים העיקריים. מספר שעות לאחר מכן, נוגדנים עודפים מוסרים עם שינויים מרובים של חוצץ.

עכשיו שהמטרות סומנו, בואו נדבר על איך לזהות אותם. עבור משניות מצומדות אנזים, זה מושג על ידי הצגת מצע כרומוגני. כאשר המצע אינטראקציה עם האנזים, שינוי צבע מתרחש, ומכאן המונח "כרומוגניק". ברגע שהכתמים הרצויים מושגים, בדרך כלל לאחר כ -2 דקות, התגובה נעצרת על ידי טבילה מהירה של החלקים במים.

לאחר כתמי נוגדנים, עדיין ייתכן שיידרש צעד שני כדי לספק הקשר נוירואנטומי כלשהו לתוצאות. לדוגמה, אתה יכול לבחור לשפר את ניגודיות הרקמות באמצעות כתם Nissl. הליך זה מסתמך על צבעים בסיסיים כמו סגול Cresyl, אשר אינטראקציה עם חומצות גרעין.

הצעד הראשון הוא לסנן את פתרון הצבע כדי להסיר גבישים לא פתורים. לאחר מכן המגלשות דוגרות בכתם עד להשגת הניגודיות הרצויה. לאחר מכן, לשטוף את החלקים בשינויים מרובים של מים כדי לעצור את הכתמים.

לאחר מכן המגלשות שקועות בסדרה של אלכוהול כדי לנקות כתם עודף ולייבש את הפרוסות. לאחר התייבשות, הפרוסות מנוקות עם קסילן, אשר מסיר את האלכוהול, ומשפר את ההדמיה שכן יש לו תכונות עקיפה אור דומה לאלה של הרקמה.

כדי לשמר את המקטעים המוכתמים לניתוח מאוחר יותר, מכסה את ההרכבה עם מדיום הרכבה קבוע ומניחים לייבוש בן לילה.

עכשיו שיש לנו מתאר את הנהלים והמטרות של כתמים מאפשר להסתכל על כמה יישומים.

ראשית, כתמים היסתולוגיים משמשים באופן שגרתי כדי לדמיין נוירונים בודדים. בתורו, ויזואליזציה נדרשת עבור טכניקות כמו microdissection לכידת לייזר, שבו חוקרים להשתמש בלייזר כדי לבודד תאים ספציפיים גדל על סרט דק. ניתן לחלץ חומר גנטי מהתאים המוכתמים והמנותחים, ומאפשרים לחוקרים לחקור ביטוי גנים ספציפיים לנוירונים.

כתמים עשויים לשמש גם כדי לאפיין תכונות מורפולוגיות של נוירונים בודדים. בניסוי זה, אימונוהיסטוכימיה מבוצעת על תאים המבטאים GFP כדי לדמיין דנדריטים היוצרים סינפסה. מכתים מושווה בין תאים רגילים ומופעלים, וחושף כי דנדריטים עוברים שינויים מרובים בתגובה להפעלת גירויים.

לבסוף, הודות לספצינות של IHC, הביטוי של חלבונים בודדים יכול לשמש כדי לזהות את המיקום והזהות של אוכלוסיות תאים ייחודיות במערכת העצבים. לדוגמה, מכתים של המוח הקטן של העכבר עם נוגדנים זברין 2 חושף את המיקום של נוירונים מיוחדים המכונה תאי Purkinje.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב להכתמה ממוקדת של פרוסות במוח. בסרטון זה הדגמנו את השיטות והמטרות הכלליות של הכתמה, בנוסף להליכים ספציפיים להכתמת IHC ו- Nissl.

תודה שצפיתם!