Overview
Para examinar o layout celular, estrutural e molecular de tecidos e órgãos, os pesquisadores utilizam um método conhecido como coloração histológica. Nesta técnica, um tecido de interesse é preservado usando fixação química e seccionada, ou cortada em fatias muito finas. Uma variedade de técnicas de coloração são então aplicadas para fornecer contraste com as seções visualmente uniformes. No estudo da neuroanação, técnicas histológicas são frequentemente aplicadas para visualizar e estudar tecido do sistema nervoso.
Este vídeo se concentra em técnicas histológicas de coloração para tecido neural. Uma visão geral das manchas cerebrais comuns é fornecida, incluindo aquelas que marcam especificamente corpos de células neuronais, como manchas de Nissl, e aquelas que destacam seletivamente axônios mieliados, como a mancha azul Luxol Fast. Técnicas imunohistológicas, que aproveitam a interação específica entre anticorpos e proteínas celulares únicas, também são discutidas. Em seguida, descreve-se a preparação de amostras cerebrais para coloração, incluindo os passos básicos para fixação, incorporação, secção e reidratação do tecido. A apresentação também fornece um procedimento passo a passo para a coloração imunohistológica seguida de uma mancha de Nissl, além de aplicações práticas dessas técnicas.
Procedure
Fatias, ou seções, de tecido cerebral são um material rico para estudar a estrutura e a função do cérebro. No entanto, o cérebro não tratado é um tecido visualmente uniforme, como uma tela em branco. A coloração é uma forma de "pintar" o cérebro para visualizar claramente os componentes celulares, estruturais e moleculares do órgão. Enquanto a maioria das manchas compartilham métodos histológicos comuns, cada abordagem tem um alvo morfológico único. Este vídeo fornecerá um esboço dos princípios gerais da histologia cerebral, demonstrará algumas técnicas comuns de coloração e revisará algumas aplicações desses métodos em laboratórios de neurociência hoje.
Antes de discutir como os procedimentos de coloração neurológica são realizados, vamos rever os objetivos dessas técnicas.
Manchas histológicas são comumente usadas para fornecer contraste, revelando características que não podem ser distinguidas em tecidos não manchados. Por exemplo, para visualizar os corpos das células neurônios, ou somata, que compõem a matéria cinzenta do sistema nervoso, múltiplas manchas estão disponíveis. Os corantes usados nas manchas de nissl se ligam aos ácidos nucleicos, colorindo o roxo somata e revelando a organização neuronal.
Alternativamente, para olhar para a matéria branca, você pode manchar a mielina - a baia de ácido graxo ao redor dos axônios - com corantes como Luxol Fast Blue. Alternativamente, a coloração imunohistoquímica pode destacar alvos moleculares encontrados em tipos celulares específicos. Esta técnica aproveita a especificidade entre anticorpos e alvos moleculares conhecidos como antígenos. O uso de anticorpos fundidos a enzimas ou compostos fluorescentes permite que os pesquisadores visualizem seus locais de ligação usando reações enzimáticas ou fluorescência.
Agora que você foi introduzido à ideia de seções de coloração, vamos olhar para os passos histológicos comuns que precedem a coloração do tecido cerebral e garantir condições ideais para visualização.
Para preservar a estrutura tecidual, o cérebro é primeiro perfundido - o que significa que o sangue é drenado do cérebro e a vasculatura do animal é usada para fornecer um fixador químico. Após a dissecação, o cérebro está totalmente imerso em fixação para completar o processo de preservação.
Em seguida, a amostra é embutida em um meio com propriedades mecânicas semelhantes ao tecido cerebral, como cera de parafina. Após a incorporação, o cérebro é finamente seccionado usando um instrumento conhecido como microtome. As fatias são então montadas em lâminas e permitidas a secar.
Como a maioria dos corantes são à base de água, o tecido precisa ser desaboado e rehidratado antes que a coloração possa começar. Para isso, os slides são enxaguados em xileno para dissolver a cera antes da reidratação gradual através de uma série de etanol cada vez mais diluído. Este processo deve ser realizado em um capuz de fumaça enquanto usa o equipamento de proteção individual apropriado.
Tendo preparado seu tecido cerebral, agora você está pronto para começar o procedimento de coloração.
O primeiro passo, conhecido como bloqueio, reduz a coloração de fundo causada pela ligação de anticorpos não específicos. Expor a seção ao soro realiza isso introduzindo anticorpos sem rótulo que se ligam a locais não-alvo. Após um bloqueio de 30 minutos para a noite, o tecido está pronto para incubação com anticorpos primários, que se liga a alvos moleculares específicos.
Os anticorpos geralmente são diluídos em uma solução de bloqueio contendo detergente, que interrompe as membranas celulares e permite que anticorpos entrem no citoplasma.
Após uma incubação durante a noite, o excesso de anticorpos primários são removidos por lavagens breves no buffer. Em seguida, os anticorpos secundários, conjugados a enzimas ou fluoroforos, são introduzidos para rotular especificamente os anticorpos primários. Várias horas depois, o excesso de anticorpos é removido com múltiplas alterações de buffer.
Agora que os alvos foram rotulados, vamos falar sobre como detectá-los. Para secundários conjugados por enzimas, isso é realizado pela introdução de um substrato cromogênico. Quando o substrato interage com a enzima, ocorre uma mudança de cor, daí o termo "cromogênico". Uma vez que a coloração desejada é alcançada, tipicamente após cerca de 2 minutos, a reação é interrompida por imergir rapidamente as seções na água.
Após a coloração de anticorpos, um segundo passo ainda pode ser necessário para fornecer algum contexto neuroanatomômico aos resultados. Por exemplo, você pode optar por aumentar o contraste tecidual usando uma mancha de Nissl. Este procedimento se baseia em corantes básicos como o violeta cresyl, que interagem com ácidos nucleicos.
O primeiro passo é filtrar a solução de corante para remover cristais não resolvidos. Os slides são então incubados na mancha até que o contraste desejado seja alcançado. Em seguida, lave as seções em várias mudanças de água para parar a mancha.
Os slides são então imersos em uma série de álcool para limpar o excesso de manchas e desidratar as fatias. Após a desidratação, as fatias são limpas com xileno, que remove o álcool, e melhora a imagem, uma vez que possui propriedades de difração leve semelhantes às do tecido.
Para preservar as seções manchadas para análise posterior, cubra com um meio de montagem permanente e deixe secar durante a noite.
Agora que delineamos os procedimentos e metas de coloração, vamos olhar para algumas aplicações.
Em primeiro lugar, a coloração histológica é usada rotineiramente para visualizar neurônios individuais. Por sua vez, a visualização é necessária para técnicas como microdissecção de captura a laser, na qual os pesquisadores usam um laser para isolar células específicas cultivadas em uma película fina. O material genético pode ser extraído das células manchadas e dissecadas, permitindo que os pesquisadores investiguem a expressão genética específica dos neurônios.
A coloração também pode ser empregada para caracterizar características morfológicas de neurônios individuais. Neste experimento, a imunohistoquímica é realizada em células expressando GFP para visualizar dendritos formadores de sinapse. A coloração é comparada entre células normais e ativadas, revelando que os dendritos sofrem múltiplas alterações em resposta à ativação de estímulos.
Finalmente, graças à especificidade do IHC, a expressão de proteínas individuais pode ser usada para identificar a localização e identidade de populações celulares únicas no sistema nervoso. Por exemplo, a coloração do cerebelo do camundongo com anticorpos zebrin 2 revela a localização de neurônios especializados conhecidos como células Purkinje.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à coloração direcionada de fatias cerebrais. Neste vídeo demonstramos os métodos gerais e objetivos de coloração, além de procedimentos específicos para coloração de IHC e Nissl.
Obrigado por assistir!
Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
