Overview
Para examinar la disposición celular, estructural y molecular de los tejidos y órganos, los investigadores utilizan un método conocido como tinción histológica. En esta técnica, un tejido de interés se conserva utilizando fijadores químicos y seccionado o cortado en lonchas muy finas. Una variedad de técnicas de tinción se aplican para proporcionar contraste a las secciones visualmente uniformes. En el estudio de la neuroanatomía, con frecuencia se aplican técnicas histológicas para visualizar y estudiar el tejido del sistema nervioso.
Este video se centra en técnicas de tinción histológicas de tejido neural. Se proporciona una visión general de manchas comunes del cerebro, como los que específicamente marcan los cuerpos neuronales de la célula, como las manchas de Nissl, los que destacar selectivamente myelinated axons, como la tinción de Luxol Fast blue. Técnicas de Immunohistological, que aprovechan la interacción específica entre los anticuerpos y proteínas celulares únicas, también se discuten. A continuación, la preparación de muestras de cerebro para la tinción se describe, incluyendo los pasos básicos para la fijación, inclusión, seccionamiento y rehidratación del tejido. La presentación también proporciona un procedimiento paso a paso para la coloración de immunohistological seguido de una tinción de Nissl, además de las aplicaciones prácticas de estas técnicas.
Procedure
Sectores o secciones de tejido cerebral son un rico material para el estudio de la estructura y función del cerebro. Sin embargo, cerebro es un tejido visualmente uniforme, como un lienzo en blanco. La coloración es una manera de "pintar" el cerebro para visualizar claramente los componentes moleculares, celulares y estructurales del órgano. Mientras más manchas comparten métodos histológicos comunes, cada enfoque tiene un único objetivo morfológico. Este video proporciona un resumen de los principios generales de la histología cerebral, demostrar algunas técnicas de tinción común y revisar algunas aplicaciones de estos métodos en los laboratorios de Neurociencia de hoy.
Antes de discutir cómo se realizan procedimientos de tinción neurológicos, permite revisar los objetivos de estas técnicas.
Manchas histológicas se utilizan comúnmente para proporcionar contraste, revelando características que no se pueden distinguir en el tejido sin manchas. Por ejemplo, para visualizar la neurona célula cuerpos o Somas, que conforman la materia gris del sistema nervioso, las manchas múltiples están disponibles. Los colorantes usados en las manchas de Nissl se fije a los ácidos nucleicos, para colorear la somata organización neuronal púrpura y revelador.
Alternativamente, para ver la materia blanca, puede manchar mielina - la vaina de ácido graso que rodea los axones - con tintes como Luxol Fast Blue. Por otra parte, la coloración de immunohistochemical puede destacar dianas moleculares encontradas tipos celulares específicos. Esta técnica aprovecha la especificidad entre anticuerpos y dianas moleculares conocidas como antígenos. El uso de anticuerpos sobre las enzimas o compuestos fluorescentes permite a los investigadores visualizar sus sitios de Unión mediante reacciones enzimáticas o fluorescencia.
Ahora que usted ha introducido la idea de tinción de secciones, permite mirar los pasos histológicos comunes que preceden a tinción de tejido cerebral y aseguran las condiciones óptimas para la visualización.
Para preservar la estructura del tejido, el cerebro es primero inundado - significado de la sangre se escurre del cerebro y vasculatura del animal se utiliza para entregar un fijador químico. Después de la disección, el cerebro está completamente inmerso en fijador para completar el proceso de preservación.
A continuación, la muestra está incrustada en un medio con propiedades mecánicas similares al tejido cerebral, como la cera de parafina. Después de la incrustación, el cerebro se secciona fino utilizando un instrumento conocido como un micrótomo. Las rebanadas son montadas en portaobjetos y deja secar.
Puesto que la mayoría los tintes son a base de agua, el tejido debe ser desparafinados y rehidratado antes de empezar la coloración. Para lograr esto, se aclaran los portaobjetos en xileno para disolver la cera antes de rehidratación gradual a través de una serie de etanol cada vez más diluido. Este proceso debe llevarse a cabo en una campana de humos mientras se está usando el equipo de protección personal.
Después de haber preparado su tejido cerebral, ya estás listo para comenzar el procedimiento de tinción.
El primer paso, conocido como bloqueo, reduce la tinción de fondo causada por Unión de anticuerpos no específicos. Exposición de la sección al suero logra introduciendo sin etiqueta anticuerpos que se unen a sitios distintos. Después de 30 minutos al bloque durante la noche, el tejido está listo para la incubación con el anticuerpo primario, que se une a dianas moleculares específicas.
Los anticuerpos generalmente se diluyen en una solución de bloqueo que contiene detergente, que altera las membranas celulares y permite que los anticuerpos entrar en el citoplasma.
Después de una incubación durante la noche, exceso anticuerpos primarios son eliminados mediante lavado breve en buffer. Luego, los anticuerpos secundarios, conjugados a enzimas o fluoróforos, se introducen para etiquetar específicamente los anticuerpos primarios. Varias horas más tardíos, el exceso de anticuerpos se quitan con múltiples cambios de tampón.
Ahora que han sido etiquetados como los objetivos, vamos a hablar de cómo detectarlos. Para secundario conjugado con enzima, esto se logra mediante la introducción de un sustrato cromogénico. Cuando el sustrato interactúa con la enzima, un cambio de color se produce, por lo tanto el término "cromogénico". Una vez lograda la coloración deseada, típicamente después de 2 minutos, la reacción se detiene rápidamente sumergiendo las secciones en agua.
Después de la coloración del anticuerpo, un segundo paso todavía se requiera para proveer algún contexto neuroanatomical los resultados. Por ejemplo, usted puede mejorar el contraste del tejido mediante una tinción de Nissl. Este procedimiento se basa en colorantes básicos como el violeta de cresilo, que interactuar con los ácidos nucleicos.
El primer paso es filtrar la solución de tinte para quitar cristales sin disolver. Las diapositivas entonces se incuban en la mancha hasta obtener el contraste deseado. Luego, lávese las secciones en varios cambios de agua para detener la mancha.
Las diapositivas entonces se sumergen en una serie de alcohol claro exceso mancha y deshidratar las rebanadas. Después de la deshidratación, las rebanadas se borran con xileno, que elimina el alcohol y mejora la imagen ya que tiene propiedades de difracción de luz similares a los del tejido.
Preservar las secciones manchadas para su posterior análisis, cubreobjetos con un medio de montaje permanente y dejar que seque durante la noche.
Ahora que hemos descrito los procedimientos y objetivos de la coloración Veamos algunas aplicaciones.
Primero apagado, tinción histológica es habitualmente utilizado para visualizar neuronas individuales. A su vez, la visualización es para técnicas como el microdissection de la captura del laser, en la que los investigadores utilizan un láser para aislar células específicas en una fina película. Puede extraer material genético de las células teñidas y disecadas, permitiendo a los investigadores a investigar la expresión de genes específicos de la neurona.
La coloración también puede emplearse para caracterizar las características morfológicas de las neuronas individuales. En este experimento, inmunohistoquímica se realiza en las células que expresan GFP para visualizar la formación de sinapsis dendritas. La coloración se compara entre células normales y activadas, revelando que las dendritas experimentan múltiples cambios en respuesta a estímulos de activación.
Por último, gracias a la especificidad de la IHC, la expresión de proteínas individuales puede utilizarse para identificar la ubicación y la identidad de las poblaciones de la célula única en el sistema nervioso. Por ejemplo, tinción de cerebelo de ratón con zebrin 2 anticuerpos revela la ubicación de las neuronas especializadas conocidas como células de Purkinje.
Sólo ha visto la introducción de Zeus a la coloración específica de rebanadas de cerebro. En este video hemos demostrado los métodos generales y objetivos de la coloración, además de procedimientos específicos para IHC y tinción de Nissl.
¡Gracias por ver!
