쥐 In Utero 전기 천공

자궁에서 전기 화는 신경 발달을 안내 하는 분자 메커니즘을 공부 하기 위한 주요 기술. 개발 설치류 뇌의 특정 영역에서 유전자 발현을 변경 하기 위해 DNA를 주입 하 여, 연구원은 그들의 자연 환경의 맥락에서 신경 세포의 확산, 분화, 마이그레이션 및 성숙을 연구할 수 있습니다.

이 비디오는 자궁 전기 화의 뒤에 주요 원리를 소개합니다, 기술을 수행하는 방법에 대한 기본 개요, 신경 생물학 연구에서 의 응용.

이 절차를 수행하는 방법을 탐구하기 전에 먼저 전기 기공의 몇 가지 원칙을 극복 할 수 있습니다. 이 절차는 세포막에 있는 일시적인 모공을 만드는 전기 펄스를 이용하여 DNA가 세포에 들어갈 수 있게 합니다. 음전하 DNA는 양극쪽으로 이동하기 때문에, 다른 세포 집단은 전기장의 위치에 따라 표적이 될 수 있다.

전기화는 전통적으로 체외 연구에서 사용되었지만, 과학적 발전은 자궁에서발생하는 마우스 배아에서 발견되는 것을 포함하여 그대로 장기로 활용을 확대했습니다.

자궁 전기포기에서는 세포 배양 또는 전 생체 기술과 달리, 전감염된 세포가 정상 발달을 이끄는 모든 생리학적 단서에 계속 노출될 것이라는 장점이 있다. 이것은 두뇌에서 특히 중요합니다, 축축과 같은 구조물은 제대로 개발하기 위하여 그밖 세포 모형에서 지도 단서를 필요로 하는 곳에 특히 중요합니다.

특히 뇌 발달은 다양한 조직 층이 전기 포기의 타이밍에 따라 표적으로 삼을 수 있다는 것을 의미하는 일련의 증식 및 이주 사건을 포함합니다.

마지막으로, 전극의 다른 모형의 가용성은 연구원이 두뇌의 표면 근처 두 지구 및 더 깊은 지역에 접근할 수 있습니다. 패들 전극은 피질과 해마와 같은 뇌의 피상적 인 부분을 대상으로 할 때 사용되며, 작은 바늘 전극은 시상 및 시상 하부와 같은 깊은 구조를 대상으로 할 때 사용됩니다.

이제 우리는 기술 뒤에 몇 가지 기본 원리를 논의했다, 그래서 우리는 외과 수술과 자궁 전기 화에 탐구 할 수 있도록 방법에서 우리의 준비를 얻을 수 있습니다.

먼저 모든 기기를 소독하고 70%의 에탄올로 수술 부위를 닦아냅니다. 다음으로, 0.1% 패스트 그린을 함유한 멸균 PBS에서 플라스미드 DNA를 용해시켜 주사용액을 만든다. 빠른 녹색은 배아에서 사출 용액의 시각화를 허용하기 위해 추가됩니다. 마지막으로, 바늘 풀러를 사용하여 양수 및 후속 태아 사망률의 손실을 줄이기 위해 초박형 바늘을 만들어야합니다.

이제 모든 것을 준비했기 때문에 설치류 를 개발하는 뇌 조직을 전기화하기위한 기본 단계를 진행할 수 있습니다. 먼저 5%의 이소플루란을 사용하여 임신한 댐을 마취한 다음, 수술 전체에 대해 2.25%의 이소플루란을 전달하는 호흡보호관으로 이송한다. 다음으로, 수술 후 통증 완화를 위해, buprenorphine 피하와 같은 진통제를 제공합니다. 그런 다음 복부를 면도하고 절개 부위를 살균합니다.

외과적으로 자궁을 드러내려면 피부의 중간선을 따라 수직 절개를하고 가위를 사용하여 회리수절단을 통과하십시오. 배아가 건조되는 것을 방지하기 위해, 멸균 식염수에 젖은 거즈로 개구부를 덮습니다. 다음으로, 배아 사슬을 복강에서 부드럽게 당겨멸균식식염수로 덮어 배아를 젖게 한다.

해부 현미경을 사용하여, 뇌에 쉽게 접근 하기 위해 제대로 배치 배아를 식별. 손가락이나 집게를 사용하여 배아의 머리를 안정시키고 자궁 벽을 통해 뇌에 DNA 용액을 주입하십시오. DNA를 전기화하려는 방향으로 양극을 머리 의 각 측면에 놓습니다. 모든 적절하게 배치 된 배아가 전극되면 자궁 경적을 복강으로 다시 배치하십시오.

절개를 닫기 전에 2 - 3 ml의 따뜻한 식염수를 캐비티에 추가하십시오. 흡수 가능한 봉합사와 함께 회합을 바느질한 다음 스테이플을 사용하여 피부를 닫습니다. 마지막으로, 가열 패드와 모니터와 케이지에 마우스를 전송합니다.

이제 자궁 전기 기화에서 수행하는 방법을 살펴보므로이 기술의 일부 다운스트림 응용 프로그램을 검사 할 수 있습니다.

자궁 에서 전기 화는 특정 유전자가 신경 발달에 기여하는 방법을 조사하기위한 유용한 도구입니다. 전기 폴레이션 구조는 야생형 또는 돌연변이 단백질의 과발현을 안내하거나 단백질 발현을 완전히 차단할 수 있습니다. 신경 학적 표현형은 현미경 또는 유기체 수준에서 평가 될 수 있습니다. 예를 들어, 이러한 실험자들은 개발 중인 마우스 뇌에서 정신 분열증 관련 유전자의 일시적인 과발현이 나중에 암페타민에 과민반응을 초래했다고 판단했다.

자궁 에서 전기 화는 또한 특정 세포 인구와 그들이 신경 조직에 형광 단백질을 인코딩 서열을 제공함으로써 그들이 만드는 연결을 시각화하는 데 유용 할 수 있습니다. 예를 들어, 이러한 실험자들은 녹색 형광 단백질 유전자를 E13.5 망막으로 전기포화하여 눈에서 뇌로 시각적 정보를 전달하는 망막 신경절 세포 또는 RGC를 연구하였다. E18.5에서 망막의 검사는 이 기술이 시신경, 시신경 및 광학 관을 통해 RGC 축축의 경로를 추적하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

마지막으로, 신경 발달에 있는 많은 중요한 사건은 출생 후에 생깁니다, 생체 내 전기화에게 불린 수정된 기술을 개발하는 과학자를 고무합니다. 이 절차는 자궁 전기 기화에서와 동일한 기본 단계를 따릅니다, 그러나 일반적으로 출생 후에 처음 며칠 안에 수행됩니다. 산후 유전 적 조작은 여기에 표시된 후각 전구 내에서 발견되는 것과 같은 나중에 태어난 세포 유형을 연구하는 데 특히 유용합니다.

당신은 자궁 전기 화에서 JoVE의 비디오를 보았다. 이 비디오에는 주요 원칙과 자궁 전기 기화에서 수행하는 방법에 대한 기본 개요뿐만 아니라 연구원이 신경 발달을 이끄는 분자 메커니즘을 조사 할 수있는 몇 가지 다운스트림 응용 프로그램이 포함되어 있습니다.

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