Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

מורין באלקטרופורציה ברחם
 
Click here for the English version

מורין באלקטרופורציה ברחם

Overview

ב אלקטרופורציה ברחם היא טכניקה חשובה לחקר המנגנונים המולקולריים המנחים את ההתפשטות, ההבחנה, ההגירה וההבשלה של תאים במהלך התפתחות עצבית. אלקטרופורציה מאפשרת אספקה מהירה וממוקדת של חומר לתאים על ידי שימוש בפולסים חשמליים כדי ליצור נקבוביות חולפות בקרומי התא. למרות אלקטרופורציה שימש באופן מסורתי במחקרים במבחנה, התקדמות מדעית הרחיבה כעת את השימוש שלה לאיברים שלמים, כגון אלה שנמצאו עוברי עכבר המתפתחים ברחם.

וידאו זה יציג את העקרונות העיקריים מאחור באלקטרופורציה ברחם בנוסף לבדיקת הטכניקות הניתוחיות הבסיסיות הנדרשות כדי לגשת לעוברים מתפתחים בתוך מכרסם בהריון. פרטים על שלבי ההזרקה והאלקטרופורציה מסופקים יחד עם שיקולים חשובים להפניית אספקת גנים לאזורי מוח ספציפיים. לבסוף, מוצגים יישומים נוירוביולוגיים של אלקטרופורציה ברחם, כגון חקירת האופן שבו גנים ספציפיים תורמים להתפתחות עצבית וכיצד נוצרים קשרים בין נוירונים מתפתחים.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ב אלקטרופורציה ברחם היא טכניקה מרכזית לחקר המנגנונים המולקולריים המנחים את פיתוח עצבי. על ידי הזרקת DNA כדי לשנות ביטוי גנים באזורים ספציפיים של מוח מכרסם מתפתח, חוקרים יכולים לחקור את ההתפשטות, בידול, הגירה, וההתבגרות של תאים עצביים בהקשר של הסביבה הטבעית שלהם.

וידאו זה יציג את העקרונות העיקריים מאחור באלקטרופורציה ברחם, סקירה בסיסית על אופן ביצוע הטכניקה, ואת היישומים שלה במחקר נוירוביולוגי.

לפני שאנו מתעמקים כיצד לבצע הליך זה, מאפשר תחילה לעבור על כמה עקרונות של אלקטרופורציה. הליך זה משתמש בפולסים חשמליים היוצרים נקבוביות חולפות בקרומי התא, ומאפשר ל- DNA להיכנס לתא. מכיוון שהדנ"א הטעון שלילית יעבור לכיוון האלקטרודה החיובית, אוכלוסיות תאים שונות יכולות להיות ממוקדות בהתאם למיקום השדה החשמלי.

למרות אלקטרופורציה שימש באופן מסורתי במחקרים במבחנה, התקדמות מדעית הרחיבה את השימוש שלה לאיברים שלמים, כולל אלה שנמצאו עוברי עכבר המתפתחים ברחם.

באלקטרופורציה ברחם, שלא כמו תרבית התאים או טכניקות ex vivo, יש את היתרון כי תאים transfected ימשיכו להיות חשופים לכל רמזים פיזיולוגיים המנחים התפתחות נורמלית. זה חשוב במיוחד במוח, שבו מבנים כגון אקסונים דורשים רמזי הדרכה מסוגי תאים אחרים על מנת להתפתח כראוי.

התפתחות המוח בפרט כוללת סדרה מתוכנתת של אירועי התפשטות והגירה, כלומר שכבות רקמות שונות יכולות להיות ממוקדות בהתבסס על תזמון האלקטרופורציה.

לבסוף, הזמינות של סוגים שונים של אלקטרודות מאפשרת לחוקרים לגשת לשני האזורים ליד פני השטח של המוח, כמו גם אזורים עמוקים יותר. אלקטרודות משוטים משמשות בעת מיקוד חלקים שטחיים של המוח, כגון קליפת המוח וההיפוקמפוס, בעוד אלקטרודות מחט קטנות יותר משמשות בעת מיקוד מבנים עמוקים כמו התלמוס וההיפותלמוס.

עכשיו כשדיברנו על כמה עקרונות בסיסיים מאחורי הטכניקה, בואו נוציא את ההכנות שלנו מהדרך כדי שנוכל להתעמק בהליך הכירורגי ובאלקטרופורציה ברחם.

ראשית, לחטא את כל המכשירים ולנגב את האזור הכירורגי עם 70% אתנול. לאחר מכן, הפוך פתרון הזרקה על ידי המסת DNA plasmid PBS סטרילי המכיל 0.1% מהיר ירוק. הירוק המהיר נוסף כדי לאפשר הדמיה של פתרון הזרקה בעובר. לבסוף, באמצעות מושך מחט, מחט דקה במיוחד חייבת להיווצר כדי להפחית את אובדן מי השפיר ואת התמותה העוברית לאחר מכן.

עכשיו שיש לנו הכל מוכן, בואו נעבור על השלבים הבסיסיים עבור אלקטרופוריאנט רקמת המוח בפיתוח מכרסמים. התחל על ידי להרדים סכר בהריון באמצעות 5% איזופלוראן ואז העברתו לצינור הנשמה המספק 2.25% איזופלוראן לכל ההליך. לאחר מכן, להקלה על כאבים לאחר הניתוח, לספק משכך כאבים כמו buprenorphine תת עורית. ואז לגלח את הבטן ולחטא את אתר החתכים.

כדי לחשוף בניתוח את הרחם, לבצע חתך אנכי לאורך קו האמצע בעור, באמצעות מספריים, לחתוך דרך הצפק. כדי למנוע מהעוברים להתייבש, מכסים את הפתח בגאזה סטרילית ספוגה מלוחה. לאחר מכן, בעדינות למשוך את השרשרת העוברית מתוך חלל הבטן להיות בטוח לשמור על העוברים רטובים על ידי כיסוי עם תמיסת מלח סטרילית מראש מחומם.

באמצעות מיקרוסקופ ניתוח, לזהות עוברים ממוקמים כראוי לגישה קלה למוח. באמצעות האצבעות או המלקחיים לייצב את הראש של העובר ולהזריק את פתרון ה- DNA דרך דופן הרחם לתוך המוח. הנח אלקטרודה בכל צד של הראש, עם האלקטרודה החיובית בכיוון שאליו אתה רוצה אלקטרופורי ה- DNA. לאחר כל העוברים הממוקמים כראוי הם אלקטרופורציה, בזהירות למקם את קרן הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן.

לפני סגירת ההסתה, להוסיף 2- 3 מ"ל של תמיסת מלח חמה לחלל. תפרו את הצי יחד עם תפרים נספגים, ואז סגרו את העור בעזרת סיכות. לבסוף, להעביר את העכבר לכלוב עם כרית חימום וצג.

עכשיו שעברנו על איך לבצע אלקטרופורציה ברחם, מאפשר לבחון כמה יישומים במורד הזרם של טכניקה זו.

ב אלקטרופורציה ברחם הוא כלי שימושי לחקור כיצד גנים ספציפיים לתרום להתפתחות עצבית. מבנים אלקטרופוריים יכולים להנחות ביטוי יתר של סוג בר או חלבונים מוטנטיים או לחסום לחלוטין את ביטוי החלבון. פנוטיפים נוירולוגיים לאחר מכן ניתן להעריך ברמה מיקרוסקופית או אורגניזמית. לדוגמה, ניסויים אלה קבעו כי ביטוי יתר חולף של הגן הקשור לסכיזופרניה, DISC-1 במוח העכבר המתפתח, הביא לרגישות יתר לאאמפטמין בהמשך החיים.

ב אלקטרופורציה ברחם יכול גם להיות שימושי להדמיה אוכלוסיות תאים ספציפיות ואת הקשרים שהם עושים על ידי אספקת רצפים קידוד חלבונים פלואורסצנטיים לתוך רקמה עצבית. לדוגמה, ניסויים אלה אלקטרופורציה גן חלבון פלואורסצנטי ירוק לתוך E13.5 רשתיות לחקור תאי גנגליון רשתית, או RGCs, אשר מעבירים מידע חזותי מהעין למוח. בדיקת רשתיות ב- E18.5 מראה כיצד ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להתחקות אחר הנתיב של האקסון של RGC דרך עצב הראייה, כיאסם אופטי ודרכי ראייה.

לבסוף, אירועים חשובים רבים בהתפתחות העצבית מתרחשים לאחר הלידה, מעוררי השראה מדענים לפתח טכניקה שונה הנקראת אלקטרופורציה vivo. הליך זה עוקב אחר אותם שלבים בסיסיים כמו אלקטרופורציה ברחם, אבל זה מבוצע בדרך כלל בימים הראשונים לאחר הלידה. מניפולציה גנטית לאחר הלידה שימושית במיוחד לחקר סוגי תאים שנולדו מאוחר יותר, כגון אלה שנמצאו בתוך נורת הריח המוצגת כאן.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב ב"אלקטרופורציה ברחם". וידאו זה הכיל עקרונות מפתח וסקירה בסיסית על אופן הביצועים של אלקטרופורציה ברחם, כמו גם כמה יישומים במורד הזרם המאפשרים לחוקרים לחקור את המנגנונים המולקולריים המנחים את פיתוח עצבי.

תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter