Elettroporazione Murina In Utero

L'elettroporazione in utero è una tecnica chiave per studiare i meccanismi molecolari che guidano il neurosviluppo. Iniettando DNA per alterare l'espressione genica in regioni specifiche del cervello dei roditori in via di sviluppo, i ricercatori possono studiare la proliferazione, la differenziazione, la migrazione e la maturazione delle cellule neurali nel contesto del loro ambiente naturale.

Questo video introdurrà i principi chiave alla base dell'elettroporazione in utero, una panoramica di base su come eseguire la tecnica e le sue applicazioni nella ricerca neurobiologia.

Prima di approfondire come eseguire questa procedura, esaminiamo prima alcuni principi dell'elettroporazione. Questa procedura utilizza impulsi elettrici che creano pori transitori nelle membrane cellulari, consentendo al DNA di entrare nella cellula. Poiché il DNA caricato negativamente si sposterà verso l'elettrodo positivo, diverse popolazioni cellulari possono essere prese di mira a seconda del posizionamento del campo elettrico.

Sebbene l'elettroporazione sia stata tradizionalmente utilizzata in studi in vitro, i progressi scientifici hanno ampliato il suo utilizzo a organi intatti, compresi quelli trovati negli embrioni di topo che si sviluppano in utero.

L'elettroporazione in utero, a differenza delle tecniche di coltura cellulare o ex vivo, ha il vantaggio che le cellule trasfettate continueranno ad essere esposte a tutti i segnali fisiologici che guidano il normale sviluppo. Ciò è particolarmente importante nel cervello, dove strutture come gli assoni richiedono segnali di guida da altri tipi di cellule per svilupparsi correttamente.

Lo sviluppo del cervello in particolare comporta una serie programmata di eventi di proliferazione e migrazione, il che significa che diversi strati di tessuto possono essere presi di mira in base ai tempi di elettroporazione.

Infine, la disponibilità di diversi tipi di elettrodi consente ai ricercatori di accedere a entrambe le regioni vicino alla superficie del cervello e alle aree più profonde. Gli elettrodi a pale vengono utilizzati quando si prendono di mira parti superficiali del cervello, come la corteccia e l'ippocampo, mentre gli elettrodi ad ago più piccoli vengono utilizzati quando si prendono di mira strutture profonde come il talamo e l'ipotalamo.

Ora che abbiamo discusso alcuni principi di base alla base della tecnica, toltiamo di mezzo i nostri preparativi in modo da poter approfondire la procedura chirurgica e l'elettroporazione in utero.

Innanzitutto, sterilizzare tutti gli strumenti e pulire l'area chirurgica con il 70% di etanolo. Quindi, fare una soluzione di iniezione sciogliendo il DNA plasmidico in PBS sterile contenente lo 0,1% di Fast Green. Il Fast Green viene aggiunto per consentire la visualizzazione della soluzione di iniezione nell'embrione. Infine, utilizzando un estrattore di aghi, deve essere creato un ago ultra sottile per ridurre la perdita di liquido amniotico e la successiva mortalità fetale.

Ora che abbiamo tutto preparato, esaminiamo i passaggi di base per l'elettroporazione del tessuto cerebrale nello sviluppo dei roditori. Inizia anestetizzando una diga incinta usando il 5% di isoflurano, quindi trasferendola su un tubo respiratorio che eroga il 2,25% di isoflurano per l'intera procedura. Successivamente, per alleviare il dolore postoperatorio, fornire un analgesico come la buprenorfina per via sottocutanea. Quindi radere l'addome e sterilizzare il sito di incisione.

Per esporre chirurgicamente l'utero, fare un'incisione verticale lungo la linea mediana nella pelle e, usando le forbici, tagliare il peritoneo. Per evitare che gli embrioni si secchino, coprire l'apertura con una garza sterile imbevuta di soluzione salina. Quindi, estrarre delicatamente la catena embrionale dalla cavità addominale assicurandosi di mantenere gli embrioni bagnati coprendo con soluzione salina sterile preriscaldata.

Utilizzando un microscopio di dissezione, identificare gli embrioni posizionati correttamente per un facile accesso al cervello. Usando le dita o la pinzetta stabilizzare la testa dell'embrione e iniettare la soluzione di DNA attraverso la parete uterina e nel cervello. Posizionare un elettrodo su ciascun lato della testa, con l'elettrodo positivo nella direzione in cui si desidera che il DNA elettroplorato. Una volta che tutti gli embrioni opportunamente posizionati sono elettroporati, posizionare con cura il corno uterino nella cavità addominale.

Prima di chiudere l'incisione, aggiungere 2 - 3 ml di soluzione salina calda alla cavità. Cucire il peritoneo insieme a suture assorbibili, quindi chiudere la pelle usando graffette. Infine, trasferire il mouse in una gabbia con una piastra riscaldante e un monitor.

Ora che abbiamo esaminato come eseguire l'elettroporazione in utero, esaminiamo alcune applicazioni a valle di questa tecnica.

L'elettroporazione in utero è uno strumento utile per studiare come geni specifici contribuiscono allo sviluppo neurale. I costrutti elettropoati possono guidare la sovraespressione di proteine wildtype o mutanti o bloccare completamente l'espressione proteica. I fenotipi neurologici possono quindi essere valutati a livello microscopico o organismisico. Ad esempio, questi sperimentatori hanno determinato che la sovraespressione transitoria del gene associato alla schizofrenia, DISC-1 nel cervello del topo in via di sviluppo, ha provocato ipersensibilità alle anfetamine più tardi nella vita.

L'elettroporazione in utero può anche essere utile per visualizzare specifiche popolazioni cellulari e le connessioni che fanno fornendo sequenze che codificano proteine fluorescenti nel tessuto neurale. Ad esempio, questi sperimentatori hanno elettroporato il gene della proteina fluorescente verde in retine E13.5 per studiare le cellule gangliari retiniche, o RGC, che trasmettono informazioni visive dall'occhio al cervello. L'esame delle retine a E18.5 mostra come questa tecnica può essere utilizzata per tracciare il percorso dell'assone RGC attraverso il nervo ottico, il chiasma ottico e il tratto ottico.

Infine, molti eventi importanti nello sviluppo neurale si verificano dopo la nascita, ispirando gli scienziati a sviluppare una tecnica modificata chiamata elettroporazione in vivo. Questa procedura segue gli stessi passaggi di base dell'elettroporazione in utero, ma di solito viene eseguita entro i primi giorni dopo la nascita. La manipolazione genetica postnatale è particolarmente utile per studiare i tipi di cellule nate più tardi, come quelle che si trovano all'interno del bulbo olfattivo mostrato qui.

Hai appena visto il video di JoVE sull'elettroporazione in utero. Questo video conteneva i principi chiave e una panoramica di base su come eseguire l'elettroporazione in utero, nonché alcune applicazioni a valle che consentono ai ricercatori di studiare i meccanismi molecolari che guidano il neurosviluppo.

Grazie per l'attenzione!