Overview
La complessità del cervello spesso richiede ai neuroscienziati di utilizzare un sistema più semplice per manipolazioni e osservazioni sperimentali. Un approccio potente è quello di generare una coltura primaria sezionando il tessuto del sistema nervoso, dissociandolo in singole cellule e facendo crescere quelle cellule in vitro. Le colture primarie rendono i neuroni e la glia facilmente accessibili agli strumenti sperimentali necessari per tecniche come la manipolazione genetica e l'imaging time-lapse. Inoltre, queste colture rappresentano un ambiente altamente controllabile in cui studiare fenomeni complessi come le interazioni cellula-cellula.
Questo video fornisce una panoramica dei principali passaggi nella produzione di colture neuronali primarie, che includono la selezione e la dissezione del tessuto di interesse, la scomposizione meccanica e chimica del tessuto per produrre una sospensione a singola cellula, la placcatura delle cellule e il mantenimento delle colture nel mezzo appropriato. Vengono inoltre presentati diversi esperimenti di esempio per mostrare come le cellule coltivate possono essere utilizzate per studiare il traffico proteico, i cambiamenti morfologici e l'elettrofisiologia nei neuroni viventi.
Procedure
Il cervello è uno degli organi più complessi del corpo, quindi i neuroscienziati spesso hanno bisogno di un sistema più semplice per le manipolazioni sperimentali e le osservazioni. La coltura cellulare è uno di questi sistemi che consente un facile accesso ai neuroni viventi. In generale, la coltura delle cellule comporta la loro crescita in soluzioni speciali chiamate mezzi di coltura all'interno di un ambiente sterile e controllabile, di solito un incubatore caldo. Una coltura primaria è quella che viene prodotta da tessuto sezionato da un organismo. Diversi tipi di colture neuronali primarie possono essere fatti da una varietà di animali, stadi di sviluppo e tessuti del sistema nervoso.
Questo video fornirà un'introduzione al metodo di produzione di colture neuronali primarie e ad alcuni degli esperimenti, che comunemente usano queste cellule.
Molti dei modelli animali importanti per la ricerca neuroscientifica possono essere utilizzati per preparare colture neuronali primarie. Con topi e ratti – due dei mammiferi più comunemente usati nella ricerca biomedica – il tessuto neuronale di embrioni, cuccioli appena nati e adulti può essere sezionato per la coltivazione. Gli embrioni e i cuccioli perinatali sono in genere preferiti poiché le cellule cerebrali sono immature e meno suscettibili ai danni.
Vari tessuti del sistema nervoso possono essere isolati e utilizzati per produrre diversi tipi di colture neuronali primarie. Ad esempio, parti specifiche del cervello possono essere sezionate, come il cervelletto, la corteccia e l'ippocampo. Il midollo spinale o componenti del sistema nervoso periferico, come i gangli della radice dorsale, possono anche essere sezionati e coltivati per far crescere specifici tipi di neuroni.
Indipendentemente dalla fonte tissutale, il metodo generale per la produzione di colture neuronali primarie può essere riassunto in alcuni passaggi principali: dissezione, dissociazione, placcatura e mantenimento.
Iniziamo una revisione approfondita di questi passaggi con il primo: Dissezione. Nella preparazione per le fasi di dissezione e coltivazione, la sterilità è fondamentale per evitare che le colture si contaminino. Gli strumenti devono essere sterilizzati con alcool e una cappa a flusso laminare viene spesso utilizzata per rimuovere i contaminanti presenti nell'aria.
Per la coltura dei neuroni dei roditori, il tessuto deve essere rimosso dagli animali appena eutanasizzati in una soluzione salina fredda e tamponata. Utilizzando un microscopio di dissezione, le parti più piccole del tessuto – come l'ippocampo – possono essere accuratamente isolate per un'ulteriore elaborazione.
Successivamente, è necessario scomporre il campione nei suoi componenti cellulari in un processo noto come dissociazione. Il tessuto sezionato viene prima tritato usando un bisturi o forbici. I pezzi di tessuto risultanti vengono quindi trasferiti in un nuovo contenitore. Un enzima proteolitico come la tripsina o la papaina viene quindi aggiunto per digerire le proteine della matrice extracellulare che legano insieme le cellule. Dopo una breve incubazione in un incubatore caldo o a bagnomaria, i pezzi di tessuto vengono delicatamente lavati con tampone per rimuovere gli enzimi.
I pezzi di tessuto ammorbidito possono ora essere dissociati mediante triturazione, che comporta il passaggio del tessuto attraverso un pipetto più volte in modo che le cellule vengano liberate in una sospensione a singola cellula. A questo punto, le cellule possono essere contate per la concentrazione e controllate per la vitalità usando macchie come il blu di trypan, che aiuta a determinare quanto la sospensione deve essere diluita per una crescita di successo.
Finalmente, i neuroni sono pronti per la cultura! Esaminiamo alcune misure importanti che devono essere prese per mantenerli vivi e sani. La composizione dei mezzi di coltura che viene utilizzata per far crescere i neuroni è molto importante. Supplementi speciali che supportano la sopravvivenza e la crescita neuronale sono di solito aggiunti ai media. Altri additivi possono includere farmaci che inibiscono la divisione delle cellule non neuronali come le cellule gliali.
Dopo che la sospensione cellulare neuronale è stata miscelata con il mezzo, le cellule sono pronte per essere placcate nei contenitori desiderati. Questi possono includere piatti e piatti di coltura o coperture di vetro collocate all'interno di questi contenitori. Poiché i neuroni non possono crescere direttamente sul vetro, i coverslip vengono trattati in anticipo per creare superfici migliori per l'attaccamento e la crescita delle cellule. Questi trattamenti possono includere il rivestimento con proteine sintetiche della matrice extracellulare; ad esempio, polilisina e laminina; o incisione acida per irruosire la superficie.
Una volta placcati, i neuroni vengono coltivati all'interno di un incubatore caldo e umidificato. La crescita dei processi neuronali può essere osservata in poche ore o giorni. Per mantenere le culture, una parte dei media culturali viene sostituita con nuovi media circa una volta alla settimana. Tipicamente, le colture neuronali primarie vengono utilizzate per esperimenti ovunque da pochi giorni a poche settimane dopo la placcatura.
Ora che hai neuroni che crescono nelle colture, cosa puoi fare con queste cellule?
Un metodo di base comunemente applicato alle colture neuronali è la manipolazione genetica mediante trasfezione o trasduzione virale. Il materiale genetico che codifica, ad esempio una proteina mutante, può essere introdotto nei neuroni coltivati per alterare la funzione neuronale. In alternativa, la trasfezione con RNA a doppio filamento è una tecnica efficace per bloccare l'espressione proteica. La disponibilità di più metodi e reagenti per la manipolazione genetica rendono questa applicazione particolarmente preziosa per un'ampia varietà di domande di ricerca.
Una domanda di esempio che può essere affrontata con le trasfezioni nelle colture neuronali è: come e dove vengono trafficate determinate proteine o complessi proteici verso le varie strutture morfologiche del neurone? Per arrivare alla risposta, i neuroni vengono trasfettate con il DNA che codifica la proteina di interesse, che può essere fusa con una proteina fluorescente come la proteina fluorescente verde o GFP. I modelli di movimento e la localizzazione della proteina marcata fluorescentemente possono quindi essere monitorati con l'imaging dal vivo. Questo metodo può essere utilizzato per studiare, ad esempio, il traffico di recettori dei neurotrasmettitori sulla superficie cellulare.
Le colture neuronali primarie sono anche molto utili per gli studi di elettrofisiologia, in cui l'attività elettrica delle singole cellule può essere misurata utilizzando microelettrodi. Il singolo strato di neuroni in una coltura significa che le singole cellule sono facili da colpire e manipolazioni come i trattamenti farmacologici vengono applicate rapidamente e in modo uniforme. Ad esempio, l'effetto di un composto di prova sull'attività di un singolo neurone può essere misurato con la tecnica del patch clamp nei neuroni in coltura.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alle culture neuronali primarie. In questo video, abbiamo dimostrato come vengono preparate queste culture e i tipi di esperimenti per i quali sono comunemente usate. Le colture neuronali primarie possono essere prodotte da un'ampia varietà di fonti tissutali, in genere utilizzando un metodo che comporta dissezione, dissociazione in una sospensione cellulare e crescita in mezzi di coltura in incubatori.
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Nessun conflitto di interessi dichiarato.
