Overview
A complexidade do cérebro muitas vezes requer neurocientistas para usar um sistema mais simples para manipulações experimentais e observações. Uma abordagem poderosa é gerar uma cultura primária dissecando tecido do sistema nervoso, dissociando-o em células únicas, e cultivando essas células in vitro. As culturas primárias tornam os neurônios e a glia facilmente acessíveis às ferramentas experimentais necessárias para técnicas como manipulação genética e imagem de lapso de tempo. Além disso, essas culturas representam um ambiente altamente controlável para estudar fenômenos complexos, como interações células-células.
Este vídeo fornece uma visão geral dos principais passos na produção de culturas neuronais primárias, que incluem selecionar e dissecar o tecido de interesse, quebrar mecanicamente e quimicamente o tecido para produzir uma única suspensão celular, emplacar as células e manter as culturas na mídia apropriada. Vários exemplos também são apresentados para mostrar como células cultivadas podem ser usadas para investigar o tráfico de proteínas, alterações morfológicas e eletrofisiologia em neurônios vivos.
Procedure
O cérebro é um dos órgãos mais complexos do corpo, então neurocientistas muitas vezes precisam de um sistema mais simples para manipulações experimentais e observações. A cultura celular é um desses sistemas que permite fácil acesso a neurônios vivos. Em geral, cultivar células envolve cultuá-las em soluções especiais chamadas mídia cultural dentro de um ambiente estéril e controlável – geralmente uma incubadora quente. Uma cultura primária é aquela que é produzida a partir de tecido dissecado a partir de um organismo. Diferentes tipos de culturas neuronais primárias podem ser feitas a partir de uma variedade de animais, estágios de desenvolvimento e tecidos do sistema nervoso.
Este vídeo fornecerá uma introdução ao método de produção de culturas neuronais primárias e alguns dos experimentos, que comumente usam essas células.
Muitos dos modelos animais importantes para a pesquisa em neurociência podem ser usados para preparar culturas neuronais primárias. Com camundongos e ratos – dois dos mamíferos mais usados em pesquisas biomédicas – tecidos neuronais de embriões, filhotes recém-nascidos e adultos podem ser dissecados para cultivo. Embriões e filhotes perinatais são tipicamente preferidos, uma vez que as células cerebrais são imaturas e menos suscetíveis a danos.
Vários tecidos do sistema nervoso podem ser isolados e usados para produzir diferentes tipos de culturas neuronais primárias. Por exemplo, partes específicas do cérebro podem ser dissecadas, como o cerebelo, córtex e hipocampo. A medula espinhal ou componentes do sistema nervoso periférico, como o gânglio raiz dorsal, também podem ser dissecados e cultivados para cultivar tipos específicos de neurônios.
Independentemente da fonte tecidual, o método geral de produção de culturas neuronais primárias pode ser resumido em alguns passos principais: Dissecção, dissociação, chapeamento e manutenção.
Vamos começar uma revisão aprofundada dessas etapas com a primeira: Dissecção. Ao se preparar para as etapas de dissecção e cultivo, a esterilidade é fundamental para evitar que as culturas se contaminem. As ferramentas devem ser esterilizadas com álcool, e uma coifa de fluxo laminar é frequentemente usada para remover contaminantes no ar.
Para a cultura de neurônios roedores, o tecido deve ser removido de animais recém-eutanizados em uma solução de sal frio e tamponada. Usando um microscópio dissecando, partes menores do tecido – como o hipocampi – podem ser cuidadosamente isoladas para um processamento posterior.
Em seguida, é necessário dividir a amostra em seus componentes celulares em um processo conhecido como dissociação. O tecido dissecado é primeiro picado usando um bisturi ou uma tesoura. As peças de tecido resultantes são então transferidas para um novo recipiente. Uma enzima proteolítica como trippsina ou papain é adicionada para digerir as proteínas da matriz extracelular que unem as células. Após uma breve incubação em uma incubadora quente ou banho de água, os pedaços de tecido são suavemente lavados com tampão para remover as enzimas.
Os pedaços de tecido suavizado podem agora ser dissociados pela trituração, que envolve passar o tecido através de uma tubulação várias vezes para que as células sejam liberadas em uma única suspensão celular. Neste ponto, as células podem ser contadas para concentração e verificadas para viabilidade usando manchas como o azul Trypan, o que ajuda a determinar o quanto a suspensão deve ser diluída para um crescimento bem sucedido.
Finalmente, os neurônios estão prontos para a cultura! Vamos rever algumas medidas importantes que precisam ser tomadas para mantê-las vivas e saudáveis. A composição dos meios culturais que são usados para cultivar os neurônios é muito importante. Suplementos especiais que suportam a sobrevivência neuronal e o crescimento são geralmente adicionados à mídia. Outros aditivos podem incluir drogas que inibem a divisão de células não neuronais, como células gliais.
Depois que a suspensão das células neuronais é misturada com a mídia, as células estão prontas para serem banhadas nos recipientes desejados. Estes podem incluir pratos de cultura e pratos ou tampas de vidro colocados dentro desses recipientes. Como os neurônios não podem crescer diretamente no vidro, as tampas são tratadas com antecedência para criar melhores superfícies para o apego e crescimento celular. Esses tratamentos podem incluir revestimento com proteínas de matriz extracelular sintética; por exemplo, poli-lysina e laminina; ou gravura ácida para endurecer a superfície.
Uma vez banhados, os neurônios são cultivados dentro de uma incubadora quente e umidificada. O crescimento dos processos neuronais pode ser observado em horas a dias. Para manter as culturas, uma parte da mídia cultural é substituída por novas mídias cerca de uma vez por semana. Normalmente, culturas neuronais primárias são usadas para experimentos em qualquer lugar de alguns dias a algumas semanas após o revestimento.
Agora que você tem neurônios crescendo em culturas, o que você pode fazer com essas células?
Um método básico comumente aplicado às culturas neuronais é a manipulação genética por transfecção ou transdução viral. A codificação de materiais genéticos, por exemplo, uma proteína mutante, pode ser introduzida nos neurônios cultivados para alterar a função neuronal. Alternativamente, a transfecção com RNA duplamente encalhada é uma técnica eficaz para bloquear a expressão proteica. A disponibilidade de múltiplos métodos e reagentes para manipulação genética fazem deste um aplicativo particularmente valioso para uma ampla variedade de perguntas de pesquisa.
Uma pergunta de exemplo que pode ser abordada com transfesões em culturas neuronais é: Como e onde certas proteínas ou complexos proteicos são traficados para as várias estruturas morfológicas do neurônio? Para chegar à resposta, os neurônios são transfectados com DNA codificando a proteína de interesse, que pode ser fundida com uma proteína fluorescente, como proteína fluorescente verde ou GFP. Os padrões de movimento e a localização da proteína fluorescente pode então ser monitorada com imagens vivas. Este método pode ser usado para estudar, por exemplo, o tráfico de receptores neurotransmissores para a superfície celular.
Culturas neuronais primárias também são muito úteis para estudos de eletrofisiologia, nos quais a atividade elétrica de células únicas pode ser medida usando microeletrodos. A única camada de neurônios em uma cultura significa que as células individuais são fáceis de atingir, e manipulações como tratamentos farmacológicos são aplicadas de forma rápida e uniforme. Por exemplo, o efeito de um composto de teste na atividade de um único neurônio pode ser medido com a técnica de grampo de remendo em neurônios cultivados.
Você acabou de assistir a introdução do JoVE às culturas neuronais primárias. Neste vídeo, demonstramos como essas culturas são preparadas e os tipos de experimentos para os quais são comumente usados. Culturas neuronais primárias podem ser feitas a partir de uma grande variedade de fontes de tecido, tipicamente usando um método que envolve dissecção, dissociação em uma suspensão celular e crescimento em meios culturais em incubadoras.
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