Overview
A transfecção - o processo de transferência de material genético para as células - é uma ferramenta poderosa para a manipulação rápida e eficiente da expressão genética nas células. Como este método pode ser usado para silenciar a expressão de proteínas específicas ou para impulsionar a expressão de proteínas estrangeiras ou modificadas, a transfecção é uma ferramenta extremamente útil no estudo dos processos celulares e moleculares que regem a função dos neurônios. No entanto, neurônios maduros têm uma série de propriedades que os dificultam a transfecção, por isso técnicas especializadas são necessárias para a manipulação genética desse tipo celular.
Este vídeo revisa os princípios e a lógica por trás da transfecção dos neurônios. Três estratégias comuns para transfecção neuronal são discutidas, incluindo nucleofecção, arma genética e transdução viral. Além de descrever como cada uma dessas técnicas supera os desafios associados à transfecção de neurônios, a apresentação inclui uma descrição de como todos os três métodos são realizados. Finalmente, várias aplicações de transfecção neuronal são introduzidas, como a expressão de proteínas tubulinas fluorescentes para visualizar a morfologia do neurônio, e o silenciamento genético seletivo para gerar um modelo de cultura celular da doença de Parkinson.
Procedure
A transfecção - a transferência de material genético para células de mamíferos - é uma ferramenta valiosa que permite aos cientistas manipular geneticamente neurônios e tecido neuronal. As propriedades únicas das células delicadas tornam a transfecção desafiadora e necessitam de técnicas especializadas.
Este vídeo revisará os princípios por trás da transfecção de neurônios e introduzirá estratégias comumente utilizadas nessas células, incluindo nucleofeipulação, transfecção biolística e transdução viral. Finalmente, discutiremos aplicações de técnicas de transfecção em pesquisas de neurociência celular e molecular.
Vamos começar revendo como funciona a transfecção. Enquanto o material genético pode ser fornecido perto de uma célula cultivada adicionando-o ao meio circundante, nucleotídeos não podem penetrar eficientemente as membranas celulares.
Todos os protocolos de transfecção são projetados para permitir que o material genético contorne essa barreira. Nucleotídeos que bloqueiam a produção de proteínas, como silenciar o RNA, podem imediatamente realizar sua função assim que entram no citoplasma. No entanto, construções baseadas em DNA devem ser transportadas para o núcleo para tradução antes que a síntese de proteínas possa começar.
Na divisão das células, a quebra do envelope nuclear durante a mitose pode resultar na incorporação do DNA transfectado na reforma dos núcleos celulares filhas. Como a maioria dos neurônios cultivados são células pós-mitóticas - ou não-divisórias - são necessárias protocolos de transfecção especializados para induzir com sucesso a expressão genética.
Vamos começar nossa visão geral desses protocolos com nucleofecção. Esta técnica utiliza uma combinação de um campo elétrico induzido e reagentes químicos, que atuam em conjunto para criar estruturas transitórias, semelhantes a poros, em membranas celulares e nucleares. Como os nucleotídeos são carregados, o campo elétrico também impulsiona o movimento do DNA através dos poros.
Para realizar este procedimento, os neurônios em suspensão são coletados em uma pelota por centrifugação antes da ressuspensão no reagente de nucleofecção comercial. A mistura celular é então combinada com DNA purificado e transferida para uma cuvette de eletroporação, que possui duas placas de alumínio que fazem contato elétrico com o aparelho nucleofector. Este dispositivo fornece uma série de pulsos elétricos rápidos, cujo número e duração são personalizados com base no tipo de célula. Após a nucleofecção, as células podem ser diluídas em cultura média e banhadas para crescimento contínuo.
Alternativamente, a técnica de armas genéticas explode através de barreiras de transfecção, atirando balas carregando material genético através de membranas celulares e nucleares.
Para fazer balas de armas genéticas, o DNA codificando seu gene de interesse é precipitado em contas em escala de míccro, geralmente compostas de ouro. Após uma incubação de 10 minutos, as contas são lavadas e transferidas para tubos. A tubulação é então girada à medida que a solução seca, resultando em um revestimento uniforme de contas. Em seguida, a tubulação é cortada em cartuchos e carregada na arma. A entrega alimentada por gás da carga genética pode ser realizada em células que crescem em placas de cultura padrão por uma simples atração do gatilho.
Por fim, a transdução viral aproveita o ciclo de vida viral para entregar material genético estrangeiro no núcleo. A codificação do RNA do gene de interesse é embalada em retrovírus modificados conhecidos como vetores lentivirais, que ganham entrada em células-alvo ligando-se a proteínas de membrana específicas, desencadeando um evento de fusão de membrana. O RNA viral é então transcrito invertido em uma cadeia de DNA complementar que é transportada para o núcleo.
Antes de iniciar este procedimento, observe que os vírus podem infectar as células do seu corpo, bem como as do seu prato, por isso seguir as diretrizes de segurança é extremamente importante.
O primeiro passo é gerar as partículas lentiviras carregando seu gene de interesse. Isso é feito expressando os blocos de construção do vírus em uma linha celular humana otimizada para produção viral, como células 293T. Para evitar a propagação desnecessária de vírus projetados, os genes necessários para sua montagem são mantidos separados do vetor de transferência, cuja sequência será incluída na partícula infecciosa.
Leva cerca de 2 dias para que os vírus totalmente montados sejam liberados no meio da cultura, onde podem ser coletados e concentrados por ultracentrifugação. Em seguida, a concentração apropriada, ou titer, do vírus é determinada pela avaliação do sucesso da transdução em uma linha celular de teste. O vetor lentiviral é então adicionado à cultura neuronal alvo e tipicamente incubado por 24 a 48 horas para garantir que a infecção tenha ocorrido.
Agora que você está familiarizado com as técnicas comuns de transfecção, o que você usa dependerá dos objetivos específicos de seus experimentos. Vamos ver alguns exemplos.
Para começar, observar o amadurecimento dos neurônios na cultura permite uma análise detalhada das alterações morfológicas que são importantes para a conectividade neuronal, como a formação de espinhas dendríticas. Para visualizar a morfologia celular ao longo do tempo, esses pesquisadores fizeram uso da nucleofecção para fornecer uma proteína fluorescente em neurônios cultos. Aqui, uma proteína de tubulina com marca fluorescente foi transfeminada em um subconjunto de células, permitindo análises detalhadas dos processos celulares através da microscopia de fluorescência. Como os níveis de expressão foram mantidos ao longo da vida do neurônio, a análise morfológica poderia ser realizada por pelo menos um mês na cultura.
A transfecção também pode ser usada para testar o impacto de mutações genéticas específicas na função do neurônio. Uma arma genética pode ser usada para fornecer dna codificando versões selvagens ou mutantes de uma proteína, e impactos de curto prazo na biologia celular podem ser avaliados, por exemplo, por meio de registro de grampos de patches de disparo de neurônios.
Por fim, uma estratégia comum para testar a função de um gene é observar o que acontece com as células quando sua expressão é bloqueada. Para esses experimentos, vetores lentivirais podem ser usados para fornecer construções de RNA silenciando, que previnem a síntese proteica. Neste experimento, a derrubada de genes associados à doença de Parkinson leva a uma diminuição significativa da viabilidade celular.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à transfecção de neurônios. Neste vídeo introduzimos princípios de transfecção de neurônios, bem como procedimentos e aplicações para três estratégias comuns de transfecção.
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Nenhum conflito de interesses declarado.
