Overview
טרנספקטיון - תהליך העברת החומר הגנטי לתאים - הוא כלי רב עוצמה למניפולציה מהירה ויעילה של ביטוי גנים בתאים. מכיוון ששיטה זו יכולה לשמש כדי להשתיק את הביטוי של חלבונים ספציפיים או כדי להניע את הביטוי של חלבונים זרים או מותאמים, טרנספקטיון הוא כלי שימושי ביותר בחקר התהליכים התאיים והמולקולריים השולטים בתפקוד הנוירונים. עם זאת, נוירונים בוגרים יש מספר תכונות שהופכות אותם קשה transfect, ולכן טכניקות מיוחדות נדרשות עבור מניפולציה גנטית של סוג תא זה.
וידאו זה סוקר את העקרונות והרציונל מאחורי טרנסג'נדרים נוירונים. שלוש אסטרטגיות נפוצות עבור transfection עצבי נדונים, כולל נוקלאופקטיון, אקדח גנים, טרנסדוקציה ויראלית. בנוסף לתיאור האופן שבו כל אחת מהטכניקות הללו מתגברת על האתגרים הקשורים לנוירונים טרנסג'נדרים, המצגת כוללת תיאור של אופן ביצוע כל שלוש השיטות. לבסוף, מספר יישומים של טרנספקטציה עצבית מוצגים, כגון ביטוי של חלבוני טובולין פלואורסצנטי לדמיין מורפולוגיה נוירונים, והשקת גנים סלקטיביים כדי ליצור מודל תרבות התא של מחלת פרקינסון.
Procedure
טרנספקטיון - העברת חומר גנטי לתאי יונקים - הוא כלי בעל ערך המאפשר למדענים לתפעל גנטית נוירונים ורקמות עצביות. המאפיינים הייחודיים של התאים העדינים הופכים את הטרנספקטיות למאתגרת ומחייבות טכניקות מיוחדות.
סרטון זה יסקור את העקרונות העומדים מאחורי טרנסג'נדרציות של נוירונים ויציג אסטרטגיות הנפוצות בתאים אלה, כולל נוקלאופקטציה, טרנס-זיהום ביוליסטי והתמרה ויראלית. לבסוף, נדון ביישומים של טכניקות טרנס-זיהום במחקר מדעי המוח התאיים והמולקולריים.
בואו נתחיל על ידי סקירת איך טרנספקטציה עובדת. בעוד חומר גנטי יכול להיות מועבר בסמיכות לתא תרבית על ידי הוספתו למדיום שמסביב, נוקלאוטידים לא יכולים לחדור ביעילות קרום התא.
כל פרוטוקולי ההדבקה נועדו לאפשר לחומר גנטי לעקוף את המחסום הזה. נוקלאוטידים שחוסמים את ייצור החלבון, כמו השתקת RNA, יכולים לבצע מיד את תפקידם ברגע שהם נכנסים לציטופלזמה. עם זאת, מבנים מבוססי DNA חייבים להיות מועברים לתוך הגרעין לתרגום לפני סינתזת חלבון יכול להתחיל.
בחלוקת תאים, פירוק המעטפה הגרעינית במהלך מיטוזה יכול לגרום לשילוב של DNA transfected לתוך רפורמה גרעיני תא הבת. מכיוון שרוב הנוירונים בתרבית הם תאים פוסט-מיוטיים - או שאינם מתחלקים - נדרשים פרוטוקולי טרנספקטציה מיוחדים על מנת לגרום בהצלחה לביטוי גנים.
בואו נתחיל סקירה שלנו של פרוטוקולים אלה עם nucleofection. טכניקה זו משתמשת בשילוב של שדה חשמלי מושרה ריאגנטים כימיים, הפועלים יחד כדי ליצור מבנים ארעיים דמויי נקבוביות הן בקרומיות התא והן בממברנות הגרעיניות. מכיוון שנוגוענים טעונים, השדה החשמלי גם מניע תנועה של DNA דרך הנקבוביות.
כדי לבצע הליך זה, נוירונים בהשעיה נאספים בכדור על ידי צנטריפוגה לפני resuspension ריאגנט נוקלאופקט מסחרי. תערובת התאים משולבת לאחר מכן עם DNA מטוהר ומועברת לקובט אלקטרופורציה, הכולל שתי לוחות אלומיניום המייצרים קשר חשמלי עם מנגנון Nucleofector. התקן זה מספק סדרה של פולסים חשמליים מהירים, שמספרם ומשך הזמן שלהם מותאמים אישית בהתבסס על סוג התא. לאחר נוקלאופקט, התאים יכולים להיות מדוללים במדיום תרבית מצופה להמשך הצמיחה.
לחלופין, טכניקת אקדח הגנים מתפוצצת דרך מחסומי טרנספקטו, על ידי ירי כדורים הנושאים חומר גנטי דרך תאים וממברנות גרעיניות.
כדי ליצור קליעי אקדח גנים, דנ"א שמקדם את גן העניין שלך מואץ על חרוזים בקנה מידה מיקרוני, בדרך כלל מורכב מזהב. לאחר דגירה של 10 דקות, החרוזים נשטפים ומועברים לצינורות. הצינורות מסתובבים לאחר מכן כמו הפתרון מתייבש, וכתוצאה מכך ציפוי אחיד של חרוזים. לאחר מכן, הצינורות נחתכים למחסניות ונטענים לתוך האקדח. משלוח מופעל בגז של המטען הגנטי יכול להתבצע על תאים הגדלים בלוחות תרבות סטנדרטיים על ידי לחיצה פשוטה של ההדק.
לבסוף, טרנסולקציה ויראלית מנצלת את מחזור החיים הנגיפי כדי להעביר חומר גנטי זר לגרעין. RNA קידוד גן העניין הוא ארוז לתוך retroviruses שונה המכונה וקטורים lentiviral, אשר מקבלים כניסה לתאי היעד על ידי קשירה חלבונים ממברנה ספציפית, מפעיל אירוע היתוך ממברנה. הרנ"א הנגיפי מתמלל הפוך לגדיל דנ"א משלים המועבר לגרעין.
לפני תחילת הליך זה, שים לב כי וירוסים יכולים להדביק את התאים בגוף שלך, כמו גם את אלה בצלחת שלך, ולכן בעקבות הנחיות בטיחות חשוב מאוד.
הצעד הראשון הוא ליצור את החלקיקים lentiviral נושאת את גן העניין שלך. זה מושג על ידי ביטוי אבני הבניין של הנגיף בקו תאים אנושיים מותאם לייצור ויראלי, כמו תאים 293T. כדי למנוע התפשטות מיותרת של וירוסים מהונדסים, הגנים הנדרשים להרכבה שלהם נשמרים בנפרד מווקטור ההעברה, שרצף שלו ייכלל בחלקיק הזיהומי.
זה לוקח בערך 2 ימים עבור וירוסים מורכבים במלואם להשתחרר לתוך מדיום התרבות, שם הם יכולים להיות נאספים ומרוכזים על ידי ultracentrifugation. לאחר מכן, הריכוז המתאים, או טייטר, של וירוס נקבע על ידי הערכת הצלחת התמרה בקו תא בדיקה. הווקטור lentiviral מתווסף לאחר מכן לתרבות העצבית היעד ובדרך כלל דגירה במשך 24 עד 48 שעות כדי להבטיח זיהום התרחש.
עכשיו שאתה מכיר את טכניקות transfection הנפוצות, אחד אתה משתמש יהיה תלוי המטרות הספציפיות של הניסויים שלך. בואו נסתכל על כמה דוגמאות.
ראשית, התבוננות בהבשלת הנוירונים בתרבות מאפשרת ניתוח מפורט של השינויים המורפולוגיים החשובים לקישוריות העצבית, כמו היווצרות קוצים דנדריטיים. כדי לדמיין את מורפולוגיית התאים לאורך זמן, חוקרים אלה עשו שימוש בנוקלאופקטיון כדי לספק חלבון פלואורסצנטי לנוירונים מתורבתים. כאן, חלבון טובולין מתויג פלואורסצנטית הועבר לתת-קבוצה של תאים, המאפשר ניתוחים מפורטים של תהליכי תאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מכיוון שרמות הביטוי נשמרו לאורך כל חייו של הנוירון, ניתוח מורפולוגי יכול להתבצע לפחות חודש בתרבות.
טרנספקטו יכול לשמש גם כדי לבדוק את ההשפעה של מוטציות גנטיות ספציפיות על תפקוד הנוירון. אקדח גנים יכול לשמש כדי לספק DNA קידוד סוג בר או גרסאות מוטנטיות של חלבון, והשפעות לטווח קצר על הביולוגיה התאית ניתן להעריך, למשל על ידי הקלטת מהדק תיקון של ירי נוירון.
לבסוף, אסטרטגיה נפוצה לבדיקת תפקודו של גן היא להתבונן מה קורה לתאים כאשר הביטוי שלו נחסם. עבור ניסויים אלה, וקטורים lentiviral יכול לשמש כדי לספק מבני RNA השתקה, אשר מונעים סינתזת חלבון. בניסוי זה, נוק-אאוט של גנים הקשורים למחלת פרקינסון מוביל לירידה משמעותית ערך התא.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב להדבקת נוירונים. בסרטון זה הצגנו עקרונות של טרנספקטציה של נוירונים, כמו גם נהלים ויישומים לשלוש אסטרטגיות transfection נפוצות.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
