高通量技术的应用 <em>体外</em> 用于构建口腔多物种生物膜的微流控系统

生物膜是结构复杂的细菌群落，聚集在各种表面¹。这些群落通常包含多种细菌，在生物膜内相互作用²。口腔生物膜是最为明显的生物膜之一，其中最显著的是牙菌斑，对人类健康构成长期挑战，其不受控制的发展会形成分类学上高度多样化的多物种群落³。这些多样化群落中的细菌成分对抗微生物药物的耐受性可比其浮游（浮游态）状态下的同类高出多达1000倍^4-6。若未能有效治疗这些可导致龋齿和牙周病的口腔生物膜群落，将带来重大的公共卫生负担：在美国，每年因口腔问题就诊牙科诊所的次数超过5亿次，用于治疗或预防牙周病和龋齿的费用约为1080亿美元⁷。

“尽管许多微生物学家主张在自然条件下研究微生物行为，但真正做到的人却很少。这是因为实验室培养工作的便利性极具吸引力，不断削弱了他们克服困难的动力。” —Smith ⁸。

目前，口腔生物膜研究采用多种方法进行 体内 和 体外 方法，各有其优势与局限性 ^9,10. 体外 方法通常采用相对易于构建的模型生物膜系统，但可能缺乏临床或实际应用的相关性 ^10,11. 在体 方法通常依赖于动物模型系统，这些系统可能再现人类口腔环境的某些方面，但由于动物与人类在解剖学、生理学、微生物学和免疫学方面的差异，仍存在局限性 ^12,13需要注意的是，口腔生物膜也可以在固定于人体志愿者口腔内支架上的牙釉质表面形成，但这种方法目前相对成本较高且费时费力 ^14,15最终，用于改善口腔健康的新型药物或技术将在受控的临床试验条件下进行人体测试。 ¹¹目前，一种常用的方法 运作方式 用于识别和评估新型口腔保健制剂的方法是首先进行实验室研究以确定其潜在功效，随后开展动物实验和由临床医生参与评估技术有效性的“现场试验”。 ^9,16,17遗憾的是，实验室研究往往依赖于占地面积大、技术上难以操作的模型系统，且通常仅包含单一或最多少数几个物种的简化群落，以期推导出潜在的实际意义 ^10,18由于牙菌斑生物膜包含多种微生物，并在复杂的唾液流动环境中形成，因此在人工培养基中培养单一或少数几种微生物所形成的生物膜，难以模拟真实情况下微生物群落的行为特征 ^10,19为解决传统实验室生物膜模型系统在时间、成本、培训要求以及相较于真实环境代表性不足等方面的问题，我们近期开发了一种高通量且更贴近环境实际的生物膜系统 ²⁰ (图1）。该系统采用无细胞的混合人源唾液（CFS）作为培养基，以及未经处理的含细菌细胞的混合人源唾液（CCS）作为接种物，具有显著优势。独特之处在于，该系统还结合了微流控技术、共聚焦激光扫描显微镜以及无需培养的细菌多样性分析技术。因此，该模型系统在环境相关性方面表现优异（使用唾液作为接种物，在37 °C下培养多物种生物膜） °C 的滤膜除菌流动唾液）中，且口腔生物膜包含多种物种（包括 链球菌, 奈瑟菌属, 韦荣球菌，以及 卟啉单胞菌属 在早期龈上菌斑中具有代表性的丰度的物种 ²⁰.

考虑到本研究描述了新开发模型系统的应用，需特别关注共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、微流控技术以及无需培养的多样性分析技术的整合。这些技术的整合由本研究团队有意实现，不仅为新开发的模型系统增添了高通量能力，还使得研究者能够提出以往其他系统难以解决的科学问题。首先，相较于传统显微镜，CLSM具有显著优势，能够实现对生物膜的三维分析。这一优势常被忽视，但实际上极为重要，因为生物膜在物种组成、空间分布以及不同空间位置所处的生理条件方面均具有高度异质性。 ^6,21结合三维重建软件和图像分析软件，可对生物膜的结构、组分菌种之间的空间关系以及抗菌杀灭效果进行分析 ^22-24这些能力无法通过标准的透射光显微镜或落射荧光显微镜实现。接下来，微流控技术在微生物学领域受到特别关注，因为它能够在严格控制的条件（如流动、温度、pH值）下研究生物膜。 等等。）且仅需少量液体 ^25-27作为对比，在流细胞模型系统（该系统可被视为目前许多口腔生物膜研究的主要模型）中，以与微流控系统相当的流速和剪切力培养口腔生物膜20小时，至少需要200 ml人唾液，而微流控装置仅需800 µl ^28-31因此，微流控模型生物膜系统能够在明确定义的条件下研究有限数量的材料。最后，在过去十年中，焦磷酸测序技术已得到优化，仅需少量材料即可进行群落分析，并具有足够的灵活性以调控测序深度，从而鉴定出罕见的生物膜物种。该技术的应用，例如细菌标签编码的FLX扩增子焦磷酸测序（bTEFAP），使得有关生物膜生态学的重要问题得以解答 ^32,33此类问题在过去曾带来诸多困难，因为当时尚无焦磷酸测序技术，构建质粒文库需要耗费大量时间和成本，且获取数据所需的技术操作与分析步骤极为复杂。 ^33,34当然，采用无需培养的方法（如焦磷酸测序）的一大优势在于，能够鉴定那些无法在常规实验室培养基中独立培养的细菌物种（即 可在该模型系统中培养并鉴定出可存活但不可培养的物种，并对其在群落中的相对丰度进行定量 ^35,36为了提供参考，早在1963年，已故的Sigmund Socransky就估计，从人口腔龈沟中分离出的材料中，约有50%的细菌无法通过实验室培养条件进行培养。 ³⁷.

本方法学论文的目的是描述在商业化微流控（Bioflux）系统中建立口腔多物种生物膜的方法，具体条件包括：（i）模拟人口腔环境的条件；（ii）物种组成和丰度与龈上菌斑相近。此外，我们利用免费软件和商业软件，重点介绍如何从共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）数据中提取生物膜基本结构参数，特别是量化生物膜生物量、粗糙度和活性（基于活/死染色）的方法。最后，本文还描述了采集生物膜样本以进行bTEFAP多样性分析所需的步骤。