Использование высокой пропускной<em&gt; In Vitro</em&gt; Микрожидкостных систему для разработки Устные биопленки Многовидовые

Биопленки архитектурно сложные сообщества бактерий, которые агрегируются на поверхности ^1. Эти общины, как правило, содержат многочисленные виды, которые взаимодействуют друг с другом в рамках биопленки ^2. Устные биопленки, наиболее визуально заметным является зубной налет, являются постоянной проблемой в людях и их бесконтрольное результаты развития в поколение таксономически различных общин многовидовых ^3. Компонент бактерии этих различных групп может быть до 1000 раз более устойчивы к противомикробным препаратам, чем их свободно плавающих (планктонных) экземплярах ^4-6. Отказ от лечения эти устные биопленки сообщества, которые могут вызвать кариес и пародонтоз, привело к значительному бремени государственного медицинского: более 500 миллионов посещений в офисе дантиста годовых в США, и примерно 108 000 000 000 $ для лечения или профилактики пародонта болезни и кариес ^7.

Содержание ">" В то время как многие микробиологи выступают изучения микробного поведения в естественных условиях, лишь немногие из них сделать. Это потому, что их боевой дух для преодоления трудностей постоянно подрывается в привлекательной простоты работы с лабораторными культурами ». -Smith ^8.

В настоящее время, оральный исследования биопленки проводится с использованием различных, в естественных условиях и в пробирке подходов, каждый со своими преимуществами и недостатками ^9,10. В пробирке подходы часто используют модельные системы биопленки, которые являются относительно легко создать, но может не хватать клинические / в реальном мире актуальность ^10,11. В естественных условиях подходы, как правило, полагаются на животных моделях, которые могут воспроизводить определенные аспекты среды полости рта человека, но опять же страдают от ограничений в связи с различиями в анатомии, физиологии, микробиологии и иммунологии между людьми и животными ^{12, 13.} Следует отметить, что оральные биопленкитакже могут быть разработаны на поверхности эмали, проводимых в стента в устьях добровольцах, но этот подход в настоящее время относительно дорогостоящим и трудоемким ^14,15. В конечном счете, новые препараты или технологии, чтобы улучшить полостью рта являются испытания на людях в контролируемых клинических условиях судебного разбирательства ^11. В настоящее время часто используются методы работы по выявлению и оценке новых пероральных препаратов Здравоохранение сначала выполнить лабораторные исследования, чтобы выявить потенциальную эффективность, а затем выполните исследований на животных и "полевые испытания", которые используют врачам оценить успешность технологии ^{9, 16,17.} К сожалению, лабораторные исследования, как правило, зависят от модельных систем, которые занимают большой след, технологически сложным в использовании, и часто содержат упрощена сообщества один или самое большее несколько видов, чтобы получить потенциальную реального мира означает ^10,18. Учитывая, что зубной налет биопленки содержать несколько видов и формы в комплэкс течет слюны среду, развитие биопленки, которые содержат один или несколько видов в искусственных средах вряд ли генерировать общин, которые ведут себя подобным образом, как и в реальной ситуации ^10,19. Для решения время, стоимость, требования к профессиональной подготовке, а бедные представительный характер лаборатория модельных систем биопленки по сравнению с реальной среде, мы недавно разработали высокую пропускную способность и экологически уместны систему биопленки ²⁰ (рисунок 1). Система выгоды от использования бесклеточной объединенной человеческой слюны (КПБ) как средний и лечить объединяются человек бактериальная клетка, содержащие слюны (CCS) в качестве посевного материала. Уникально, система также объединяет микрофлюидальный технологии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и культуры независимой технологии анализа бактериальной разнообразия. Таким образом, модель системы является экологически уместны (с помощью слюны, как посевной расти биопленки Многовидовые на 37 ° С в фильтр-стерилизовать течетслюна) и устные биопленки содержат виды (включая Streptococcus, Neisseria, Veillonella и видов Porphyromonas) в численности, представитель те, что в начале наддесневого налета ^20.

Если учесть, что эта работа описывает использование недавно разработанной модельной системы, особое внимание должно быть уделено объединения конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) микрофлюидики и технологий анализа разнообразие культурно-независимыми. Объединение этих технологий нашей исследовательской группы было преднамеренным, а не только добавляет возможность с высокой пропускной во вновь разработанной модельной системы, но также позволяет задаваемых вопросов, которые не могут быть легко решены до с другими системами. Во-первых, CLSM имеет явные преимущества по сравнению с традиционными микроскопии, так как позволяет для трехмерного анализа биопленок. Часто недооценивают, это очень важно, так как биопленки являются гетерогенными остроумиеч относительно видового состава и пространственного положения, а также физиологические условия быть введены в различных пространственных местах в пределах биопленки ^6,21. В концерте с трехмерной программного обеспечения визуализации и программного обеспечения для анализа изображений, архитектуры биопленки, пространственных отношений между составляющих его видов и степени антибактериальной убийства могут быть проанализированы ^22-24. Такие способности невозможно с использованием стандартного проходящего света или эпифлуоресцентной микроскопии. Далее, микрофлюидики собрал особое внимание в области микробиологии, так как позволяет изучение биопленок в тщательно контролируемых условиях (расход, температура, рН и т.д.) и требует только небольших объемов жидкости ^25-27. В качестве отправной точки для сравнения, рост устный биопленки в слюне человека в рамках модели проточной ячейки системы (система, которая, возможно, считается основой образцом для многих оральных исследований биопленки) в течение 20 ч при аналогичной скорости потока и сдвига, как достичьв микрожидкостных системы требует, по крайней мере, 200 мл, в противоположность 800 мкл в микрожидкостных устройств ^28-31. Таким образом, Микрожидкостных модель системы биопленки позволяет исследовать количество ограниченных материала при определенных условиях. Наконец, пиросеквенирования технология была оптимизирована в последнее десятилетие требуют лишь небольшое количество материала для выполнения анализа сообщество и достаточно универсален, чтобы контролировать глубину последовательности, чтобы получить идентичность даже редких видов биопленки. Использование этой технологии, такие как бактериальный тегом в кодировке FLX ампликон пиросеквенирования (bTEFAP), позволило актуальных вопросов, касающихся экологии биопленок решать ^32,33. Такие вопросы проникнуты трудности в прошлом, когда пиросеквенирования не были доступны из-за времени и затрат, необходимых для создания плазмиды библиотеки и сложные технологические и аналитические шаги, необходимые для получения данных ^33,34. Конечно, большое преимущество с культурно-независимый APжается, такие как Пиросеквенирование, является то, что виды бактерий, которые не могут быть выращены в изоляции в обычных лабораторных средах (т.е. жизнеспособные, но не культивируемой видов) могут быть выращены и определены в модельной системе, и их относительное содержание в сообществе количественно ^{35, 36} , Чтобы добавить перспективу, а уже в 1963 году, в конце Зигмунд Socransky, что приблизительно 50% бактерий в материале, выделенных из полости рта человека десны щель не может быть культивировать, используя условия роста лаборатория ^37.

Цель этого методы работы является описать подход для разработки устные биопленки Многовидовые в коммерчески доступных микрожидкостных (Bioflux) системы: (I) условий представителя полости рта человека и (II) с видового состава и численности, что сравнима с наддесневого налета. Кроме того, как с помощью бесплатных и коммерческих программ мы выделяем как основной биопленкиархитектура меры могут быть получены из данных CLSM, с акцентом на подходы к количественной оценке биопленки биомассы, шероховатости и жизнеспособность (на основе Live / Dead окрашивания). Наконец, шаги, необходимые для сбора биопленки материал для анализа разнообразии bTEFAP описаны.