Overview
Morpholino-mediated gene silencing est une technique courante utilisée pour étudier les rôles des gènes spécifiques au cours du développement. Les morpholinos inhibent l’expression de gène par hybridation de l’ARNm complémentaire. En raison de leur composition chimique unique, les morpholinos sont faciles à produire et à stocker, ce qui les rend remarquablement rentable par rapport aux autre gene silencing des méthodes.
Cette vidéo clients conception expérimentale appropriée lorsque vous utilisez ces oligonucléotides. Après que, une explication des techniques de microinjection morpholino chez le poisson zèbre et l’analyse des phénotypes résultants seront discutées. Enfin, nous présentons des exemples d’applications spécifiques où morpholino technologie est utilisée pour modéliser des troubles du développement ou d’étudier la régénération des tissus.
Procedure
Gène silencieux techniques sont couramment utilisés dans le domaine de la biologie du développement. Approches morpholino-knockdown régulièrement aux chercheurs à la fois identifier et caractériser des gènes impliqués dans les processus cellulaires importants. Antisens morpholinos sont maintenant très populaires dans de nombreux systèmes de modèle, y compris la souris, poussins et le poisson-zèbre, en raison de leur grande efficacité, une spécificité élevée et faible coût.
Cette vidéo donnera un aperçu des mécanismes morpholino et stratégies de microinjection, principaux contrôles expérimentaux et comment les morpholinos sont utilisés dans les laboratoires aujourd'hui pour étudier le développement des vertébrés.
Les morpholinos ont été développés tout d’abord comme un moyen d’inhiber la traduction des ARN transcrits dans les cellules vivantes et les organismes. Généralement, les morpholinos sont des molécules synthétiques, composés de 25 oligonucléotides reliés par une colonne vertébrale neutres chargée.
Mais bien que les morpholinos peuvent ressembler beaucoup à ADN, ils contiennent des anneaux de morpholine en lieu et place des groupes de sucre retrouvées dans phosphate sucre squelette. Cette conversion simple augmente la stabilité morpholino dans les cellules et réduit leur coût de production.
À l’intérieur des cellules, les morpholinos sont ciblés à l’ARN d’intérêt par appariement de base complémentaires. L’emplacement de l’ARN où le morpholino s’hybride détermine son mécanisme d’action spécifique.
Épissure bloquant les morpholinos se lient aux jonctions spécifiques et inhiber la transcription correcte transformation, alors que les morpholinos blocage traduction lier au sein de la région non traduite en 5' du gène près du lieu de départ et qu’assemblage du ribosome. Les deux types de morpholinos réduisent l’expression de protéines cibles fonctionnelles.
Lorsque vous planifiez une expérience utilisant les morpholinos, il y a quelques considérations importantes à garder à l’esprit. Les morpholinos peut être utilisés dans plusieurs systèmes de modèle, il est donc important de choisir un modèle qui est en mesure d’aborder la question biologique à portée de main.
Les morpholinos sont synthétisées dans le commerce et assistance conception professionnelle est disponible sans frais aux chercheurs, mais parce qu’ils sont des séquences spécifiques, information génétique pour toutes les cibles spécifiques morpholino devrait être d’origine avant de concevoir.
Dans le système de modèle de poisson-zèbre, il y a souvent deux copies de gènes unique qu’on retrouve chez d’autres vertébrés, en raison d’un événement de duplication du génome entier qui est survenue dans un ancêtre évolutionnaire du poisson-zèbre. Par conséquent, précipitation des deux gènes de poisson-zèbre peut être nécessaire avec succès les lacunes de protéine modèle dans le développement humain.
Conception de bons contrôles expérimentaux est tout aussi importante que de concevoir votre morpholinos ciblées. Toute donnée morpholino peut lier à des séquences spécifiques sur différents gènes. Il est conseillé d’utiliser les morpholinos indépendants, non-cumul complémentaires du même gène, afin d’assurer un changement phénotypique observé en raison de la précipitation de votre gène d’intérêt.
Maintenant que nous avons adressée morpholino expérimental, ayons Regardez comment les morpholinos sont introduits de poisson-zèbre.
Ici, nous allons décrire morpholino microinjection dans poisson zèbre. Pour plus de perspicacité et d’instructions sur les détails de la microinjection, s’il vous plaît référence le JoVE Science Education vidéo intitulé « Techniques de Microinjection de Zebrafish. »
Les morpholinos sont généralement injectés dans des embryons de poisson-zèbre entre le stade unicellulaire et quatre-, dans le jaune ou le cytoplasme de cellules. Des connexions cytoplasmiques entre cellules embryonnaires permettent une diffusion rapide et livraison omniprésent des morpholinos soluble dans l’eau tout au long de l’organisme. Les morpholinos sont stables dans les cellules, l’embryon de poisson zèbre étant déclenché à 28,5 ° C.
Volumes et concentrations d’injection optimale doivent être testés empiriquement pour chaque morpholino. En règle générale, la dose la plus faible au cours de laquelle il y a un phénotype fiable défini dans au moins 50-75 % des embryons injectées est utilisée afin d’éviter la létalité embryonnaire ou hors-cible des effets indésirables.
La plupart morpholino zebrafish phénotypes sont identifiés dans la première fécondation après trois jours, et de silençage génique est généralement efficace par le biais de cinq jours. Dans le cas de blocage d’épissage morpholinos, RT-PCR permet d’identifier les quantités relatives des transcriptions natives et altérées. Pour blocage traduction morpholinos, ordres de gène peuvent être évaluées par Western blot.
Le rapid développement externe et la transparence des embryons de poisson-zèbre permet une observation facile de nombreux processus biologiques précoces. Phénotypes morpholino peuvent généralement être marqués en analysant la morphologie microscope à fond clair ou la fluorescence, ainsi qu’en évaluant le comportement.
Après avoir défini le phénotype morpholino, sauvetage de RNA peut être effectuée pour démontrer la spécificité de cible. Après morpholino knockdown de l’ARNm endogène, ARNm synthétique est injecté, qui code la protéine même, mais ne contient pas la séquence cible morpholino. Si cet ARN injecté est en mesure de restaurer le phénotype sauvage de l’organisme, alors nous pouvons conclure que le phénotype observé morpholino est précisément à cause du gène cible se renversé.
Maintenant que vous avez une idée pour que les morpholinos sont et comment contrôlé morpholino expériences peuvent être effectuées, nous allons étudier comment les morpholinos sont appliquées dans les laboratoires de biologie aujourd'hui.
En biologie cellulaire, les morpholinos sont utilisés pour comprendre les processus de développement précoces. Écoulement de fluide cils généré dans la vésicule de Kupffer est un exemple, qui contrôle la structuration de la gauche-droite chez le poisson zèbre. Écoulement des fluides s’exécute dans le sens antihoraire dans des embryons de contrôle à injection, alors que le silence d’un gène qui régule l’organisation de cellules ciliées perturbe la direction et la vitesse de fluide.
Les morpholinos sont également très adaptées rapidement et sûrement modéliser des maladies génétiques humaines. Phénotypes de la perte de fonction peuvent être facilement reproduits en manipulant l’expression de la protéine, comme on le voit dans un modèle de poisson-zèbre de dysplasie humaine affichant des kystes rénaux, péricardique œdème et une queue enroulée. En outre, mutations pathogènes peuvent être rapidement dosées in vivo à l’aide d’ARNm sauvage ou mutant pour secourir les phénotypes maladies morpholino.
Étant donné que les morpholinos peuvent être introduits dans les cellules vivantes de différentes façons, ils sont très appréciés dans l’étude de développement et la régénération de l’orgue. Microinjection suivie d’une stimulation électrique des morpholinos dans des tissus spécifiques a permis aux chercheurs d’étudier la croissance de nageoire et la formation de la rétine chez le poisson zèbre adulte.
Vous avez juste regardé introduction de JoVE de silençage génique avec morpholinos. Dans cette vidéo, nous avons discuté de la structure et le mécanisme des morpholinos, applications courantes d’utilisation et des moyens importants pour évaluer l’efficacité et les effets de silençage génique ciblée. Parce qu’ils sont faciles à conception, très spécifiques et rentables, les morpholinos restera un acteur important dans le domaine de la génétique inverse, aidant à analyser sur le plan fonctionnel des gènes impliqués dans la maladie et le développement. Merci de regarder !
