Overview
L'ibridazione in situ a montaggio intero (WMISH) è una tecnica comune utilizzata per visualizzare la posizione degli RNA espressi negli embrioni. In questo processo, le sonde di RNA prodotte sinteticamente vengono prima legate in modo complementare, o "ibridate", ai trascritti dei geni bersaglio. L'immunoistochimica o fluorescenza viene quindi utilizzata per rilevare questi ibridi di RNA, rivelando modelli spaziali e temporali di espressione genica. A differenza delle tradizionali tecniche di ibridazione in situ, che richiedono sezioni di tessuto sottile le cui immagini dovranno essere riassemblate computazionalmente, la tecnica a montaggio intero consente di valutare i modelli di espressione genica sull'intero embrione o struttura.
Questo video introdurrà i concetti di base della colorazione dell'intero supporto e descriverà in dettaglio le fasi procedurali chiave, tra cui la progettazione e la produzione della sonda, la fissazione e la colorazione dell'embrione e il rilevamento del segnale post-ibridazione. Gli spettatori impareranno quindi come i biologi dello sviluppo stanno applicando WMISH agli studi di ricerca attuali.
Procedure
L'ibridazione in situ a montaggio intero è una tecnica potente che consente agli scienziati di comprendere le basi molecolari dello sviluppo embrionale. "Whole-mount" indica che verrà utilizzato l'intero embrione, non solo una fetta di tessuto. "In situ" è una frase latina che significa "in posizione". E infine, "ibridazione" si riferisce al legame complementare di una molecola di RNA prodotta sinteticamente a un trascritto di mRNA all'interno della cellula di un organismo.
Questo video mostrerà la procedura, i risultati attesi e le applicazioni selezionate di questa tecnica che possono consentire una migliore comprensione dei disturbi dello sviluppo.
I geni alla base della morfogenesi dell'organismo sono espressi in modelli temporalmente e spazialmente limitati durante il corso dello sviluppo embrionale.
Le sonde di RNA prodotte sinteticamente, chiamate ribosonde, vengono utilizzate per rilevare gli mRNA mediante legame complementare. I ribosonde sono etichettati con nucleotidi speciali contenenti "apteni", come dinitrofenolo, biotina o digossigenina. Gli apteni sono molecole che possono suscitare una risposta immunitaria quando sono attaccate a molecole più grandi e sono quindi bersagli per il legame degli anticorpi. Questi anticorpi di rilevamento sono coniugati a enzimi, come la perossidasi di rafano o la fosfatasi alcalina, che catalizzano reazioni chimiche in cui può essere depositato un colorante fluorescente o colorato.
Le tradizionali tecniche di ibridazione in situ richiedono la preparazione di sezioni tissutali di un embrione per facilitare la rilevazione delle strutture interne. Di conseguenza, una valutazione completa dell'espressione genica in tutto l'organismo dovrà essere ricostruita dalle fette di tessuto da 5-6 μm con l'aiuto di un software per computer. Tuttavia, con lo sviluppo di tecniche a monte intero, è possibile ottenere l'analisi dell'espressione genica su distanze maggiori all'interno dell'intero embrione.
Dopo aver esaminato i principi alla base dell'ibridazione in situ a montaggio intero, esaminiamo il protocollo sperimentale passo dopo passo.
Il primo passo di questa procedura prevede l'identificazione della sequenza bersaglio nell'organismo modello da studiare. La sequenza di DNA bersaglio viene quindi amplificata mediante PCR utilizzando primer contenenti sequenze di inizio della RNA polimerasi. Il modello di DNA amplificato è ora trascritto in vitro con nucleotidi etichettati con hapten. Questa ribosprobe etichettata hapten è ora pronta per la fase di ibridazione.
Gli embrioni sono preparati per l'ibridazione tramite fissazione con formaldeide, un reagente reticolante che stabilizza le proteine e protegge dalle RNasi. Dopo la fissazione, la formaldeide viene rimossa lavando l'embrione più volte con soluzione salina tamponata con fosfato contenente una piccola quantità di detergente, come Tween. Per rimuovere i lipidi cellulari e facilitare la penetrazione della sonda nei tessuti, gli embrioni vengono disidratati in una serie graduata di lavaggi a metanolo, ad esempio: 25%, 50%, 75%, 100% metanolo. Gli embrioni possono essere conservati al 100% in metanolo per un massimo di un mese (o più) a -20°C.
Per preparare gli embrioni all'ibridazione, devono essere reidratati da una serie graduata di lavaggi di metanolo con progressivamente meno metanolo per lavaggio. Gli embrioni vengono quindi digeriti con una proteasi per facilitare la diffusione della ribosonda nei tessuti. La ribosprola etichettata viene aggiunta all'embrione e viene effettuata l'ibridazione.
I lavaggi post-ibridazione vengono eseguiti per rimuovere le ibridazioni non specifiche. Le RNasi A e T1 vengono aggiunte per rimuovere le sonde ibridate in modo incompleto digerendo l'RNA a singolo filamento. Le sonde ibridate vengono rilevate con un coniugato anticorpo-enzima che lega le ribosonde marcate con hapten. Come accennato in precedenza, enzimi come la fosfatasi alcalina sono coniugati ad anticorpi specifici di hapten e vengono rilevati aggiungendo substrati enzimatici per suscitare un cambiamento di colore. Il prodotto di reazione forma un precipitato viola scuro che segna la posizione dell'mRNA espresso, come si vede in questo esempio.
Ora che sai come fare l'ibridazione in situ a montaggio intero, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni della tecnica.
L'ibridazione in situ a monte intero è stata utilizzata per aiutare gli scienziati ad affrontare malattie mortali trasmesse dalle zanzare, come la malaria, la febbre dengue e la malattia del Nilo occidentale. Caratterizzando i geni coinvolti nella riproduzione e nello sviluppo delle zanzare, nuovi insetticidi biologici o chimici possono essere progettati per indirizzare meglio le zanzare portatrici di malattie.
Un'altra applicazione di questa tecnica prevede la caratterizzazione dei cambiamenti del modello di espressione genica associati all'esposizione a teratogeni o agenti che interferiscono con lo sviluppo fetale.
Qui, l'ibridazione in situ a monte intero è stata utilizzata in un modello zebrafish di sindrome alcolica fetale per identificare i geni i cui modelli di espressione vengono modificati dopo l'esposizione all'alcol. Questo può aiutare nello sviluppo di terapie per mitigare le conseguenze dell'esposizione all'alcol in utero.
L'ibridazione in situ a montaggio intero può anche essere utilizzata per convalidare i cambiamenti fenotipici associati alle malattie congenite. Le mutazioni associate alla sindrome di Bardet-Biedl sono state introdotte negli embrioni di zebrafish attraverso mRNA mutanti prodotti sinteticamente. Dopo un periodo di tempo definito, gli embrioni sono stati divisi in gruppi in base alla gravità dei difetti. La visualizzazione dell'espressione dei geni a valle del gene mutato è stata utilizzata per convalidare i cambiamenti fenotipici. Pertanto, l'ibridazione in situ a monte intero in combinazione con il punteggio fenotipico può facilitare una migliore comprensione dei ruoli di specifiche mutazioni alla base dei difetti dello sviluppo.
Hai appena visto il video di JoVE sull'ibridazione in situ a montaggio intero. Questa tecnica è un potente strumento che consente una precisa caratterizzazione temporale e spaziale dell'espressione genica all'interno di un organismo. L'ibridazione in situ a monte intero viene attualmente utilizzata per generare un atlante di modelli di espressione genica durante lo sviluppo in una moltitudine di organismi modello. Questi studi possono facilitare lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento di malattie umane, tra cui il cancro. Grazie per l'attenzione!
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
