Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Developmental Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

תרבית ובידול תאי גזע עובריים
 
Click here for the English version

תרבית ובידול תאי גזע עובריים

Overview

פולחן תאי גזע עוברי (ES) דורש תנאים השומרים על תאים אלה במצב לא מואמצת כדי לשמר את יכולתם להתחדשות עצמית ופלוריפוטנציה. ביולוגים של תאי גזע ממטבים ללא הרף שיטות לשיפור היעילות של תרבית תאי ES, ובמקביל מנסים לכוון את הבידול של תאי ES לסוגי תאים ספציפיים שניתן להשתמש בהם ברפואה רגנרטיבית.

סרטון וידאו זה מתאר את העקרונות הבסיסיים של תרבית תאי ES, ומדגים פרוטוקול כללי לגידול ומעבר של תאי ES. אנו גם בוחנים מקרוב את שיטת הטיפה התלויה, המשמשת להבחנה בין תאי ES. לבסוף, וידאו זה יתאר כמה יישומים של תרבית תאים ES וטכניקות בידול, כולל שיטה המשמשת ליצירת תאי שריר לב פונקציונליים במבחנה.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

לתאי גזע עובריים, או לתאי ES, יש מספר תכונות ייחודיות המבדילות אותם מתאים בוגרים רגילים. לכן, מדענים המציאו טכניקות פולחן מיוחדות כדי לשמור או לנצל תכונות אלה. כאשר הם מתרבתים כראוי, תאי ES יכולים להתחלק ללא הגבלת זמן כדי להפיק מעצמם יותר. יחד עם זאת, על ידי שינוי תנאי culturing, תאי ES ניתן לכוון להבדיל כמעט לכל סוג תא שנמצא בגוף שלנו; יכולת זו של תאי ES נקראת "פלוריפוטנסיה".

בסרטון זה, אתה הולך ללמוד כיצד לתרבות ולהעברת תאי ES כך שהם שומרים על המאפיינים הייחודיים שלהם, כיצד לגרום לבידול בתאי ES כדי ליצור סוגי תאים ספציפיים, ואת הדרכים שבהן ES תאים culturing וטכניקות בידול משמשים מעודן על ידי חוקרים היום.

לפני הכניסה לפרטים של ההליכים לתחזוקת תא ES, חשוב להבין תחילה מה מונע או מניע בידול תאים ES. על מנת שתאי ES ישמרו על תכונותיהם הייחודיות של פלוריפוטיות והתחדשות עצמית, הם חייבים להיות תרבותיים עם גורמים ספציפיים במדיום הצמיחה שלהם המדכאים בידול ספונטני.

זה נעשה בדרך כלל על ידי פולחן תאי ES על שכבה של "מזינים", בדרך כלל פיברובלסטים עובריים עכבר, או MEFs. תאי מאכיל "מזינים" את תאי ה- ES גורמים מסוימים, כגון activin A, המסייעים לשמור על תאי ES במצבם הלא מוערך.

לאחרונה, מדענים פיתחו גם שיטות פולחן ללא מאכיל שבו תאי ES גדלים במדיה עם הגורמים הדרושים הוסיף מתכון מוגדר. גישה זו מפחיתה את השונות ומסירה את הרכיב הלא אנושי מתרביות תאי ES, המהווה תנאי מוקדם ליישומים קליניים.

מאפיין נוסף של תאי ES הוא שהם גדלים באופן טבעי באשכולות או במושבות, ונוטים להיות בעלי שיעור הישרדות נמוך כאשר הם מנותקים לתאים בודדים, במיוחד תאי ES אנושיים. כתוצאה מכך, העברת תאי ES אנושיים דורשת בדרך כלל שמירה עליהם בגושים שלמים באמצעות "קטיף" מכני.

כאשר תאי ES גדלים בתנאים שאינם דבקים, הם יוצרים אגרגטים תלת-ממדיים המכונים גופים עובריים, או EBs, שבהם תאי ה- ES יתבדלו לכל סוגי התאים השונים. על ידי שינוי תנאי הבידול, כגון הוספת גורמי גדילה ספציפיים למדיום, מדענים מפתחים שיטות לכוון את בידול תאי ES לסוגי תאים ספציפיים.

כעת, כאשר אתם מבינים את העקרונות שמאחורי תחזוקה ובידול של תאי ES, בואו נבחן כיצד לתרבות ולעבר תאי ES במזיני MEF.

MEFs מתקבלים מעוברי עכבר בשלב מוקדם, ולאחר מכן הם מומתים על ידי כימיקלים או קרינה כדי למנוע מהם חלוקה נוספת. MEFs מומת צריך להיות מצופה על מנות תרבית רקמות ג'לטין לפחות יום אחד לפני תחילת תרבות תאי ES. כאשר המאכילים מיושבים במלואם, תאי ES מופשרים ונזרעים על הלוחות.

במהלך הימים הקרובים, תאי ES יגדלו למושבות גדולות. לפני שהמושבות מתחילות לגעת ולמזג, יש להעביר את תרבות ה- ES. יש לבחון את המורפולוגיה של תאי ES כדי לראות אם הם מראים סימנים של בידול. מושבות ES לא מובחנות נראות בדרך כלל מוגדרות היטב והומוגניות, בעוד שתאים מובחנים ייראו כמו "אבני ריצוף" משעממות, לא סדירות.

אם המושבות מראות 70% או יותר של בידול, או אם הן דלילות, חותכות באופן מכני את המושבות הלא מובחנות ומעבירות אותן ללוח הזנה חדש. אחרת, פשוט להסיר את האזורים המובחנים או מושבות ולהמשיך עם passaging.

לאחר המושבות המובחנות נוקו, אנזימים פרוטאוליטיים, כמו collagenase, מתווספים להרים את התאים מהצלחת עם דגירה ב 37 °C למשך הזמן המתאים. לאחר מכן מתווספת מדיית ES טרייה כדי לעצור את התגובות האנזימטיות. המושבות מפורקות באופן מכני מהצלחת ומועברות לצינור צנטריפוגה, שם הן מתפרקות לגדלים הרצויים עם צינורות עדינים. תאי ה- ES נאספים על-ידי צנטריפוגה, נאספים מחדש במדיה של ES ומוצמדים ללוחות המאכילים המוכנים.

לאחר שלמדנו כיצד להעביר תאי ES, בואו נסתכל על אחת הטכניקות הנפוצות יותר המשמשות להבחנה בין תאי ES לגופים עובריים - שיטת הטיפה התלויה.

בתור התחלה, תאי ES מנותקים בעזרת אנזימים פרוטאוליטיים כמו קולגנאז, ומדוללים לריכוז הרצוי במדיה המכילה גורמי בידול ספציפיים לשושלת היוחז. השעיית תא ES מופקדים בטיפות על המכסה של צלחת פטרי חיידקית. המכסה הפוך במהירות ומניח על המנה, כך שהטיפות התקשורתיות יתלו במהופך ויאפשרו לגופים העובריים להתפתח.

לאחר יומיים, ניתן לאסוף את הטיפות עם EBs ולמצוות על לוחות שאינם דבקים לפולחן נוסף. בנקודת הזמן המתאימה לשושלת התאים הרצויה, גופי העובר מצופים בחזרה למנות תרבית רקמות דבקות ג'לטיניות לבידול נוסף.

כעת, לאחר שכיסינו את הטכניקות הבסיסיות של פולחן והבחנה בין תאי ES, בואו נבחן כיצד הם מותאמים לצרכים ניסיוניים ספציפיים.

כפי שהוזכר קודם לכן, תאי ES יכולים להיות מכוונים להבדיל לסוגי תאים ספציפיים בתנאי פולחן שונים. בניסוי זה, מדענים הפיקו נוירונים מוטוריים מתאי ES אנושיים. זה נעשה על ידי הוספת גורמים ראשונים להבחנה בין גופים עובריים המכוונים אותם לשושלת העצבית, ואחריו כימיקלים ותנאי ציפוי שהופכים תאים אלה במיוחד לנוירונים מוטוריים. באמצעות גישות דומות, החוקרים הצליחו להבדיל תאי ES לתאי שריר הלב הפועמים בקצב.

מכיוון שהבחנת תאי ES מחקה אירועים המתרחשים כאשר עוברים מתפתחים באופן טבעי, אנו יכולים גם להשתמש בהם כדי לחקור את הביולוגיה של התפתחות עוברית מוקדמת. אחת התופעות הנחקרות היא אי-ההמתה של X-כרומוזום, או XCI, התהליך המכריע לפיו אחד משני כרומוזומי ה-X מושתק בכל תא של יונק נקבה. על ידי הדמיית ההתפלגות של RNAs ספציפיים וחלבונים בפיתוח EBs, מדענים השיגו תובנות חשובות על הביולוגיה של XCI.

לבסוף, כדי להגביר את העקביות והיעילות של ניסויים בתאי ES, מדענים מנסים ללא הרף להמציא טכניקות טובות יותר לתאי ES. גישה אחת היא לגדל תאי ES בשכבה אחת, הנקראת פולחן מונו-שכבתי שאינו מושבה, או NCM.

זוכרים שתאי ES אנושיים נוטים להיות אומללים כאשר הם לא גדלים כצברגים תלת-ממדיים? מדענים הראו כי כימיקלים המכונים מעכבי ROCK להגדיל את ההישרדות של תאי ES מנותקים, המאפשרים להם להיות מעבר כמו השעיות תא יחיד, ולהיות מצופה בצפיפות גבוהה. היתרון של טכניקת NCM הוא שכל תא יהיה חשוף באופן שווה יותר לגורמי גדילה וחומרים מזינים במדיום, מה שמפחית את ההטרוגניות בתוך התרבות תוך כדי הקלה על גידול תאי ES במספרים גדולים.

הרגע צפית בסרטון של JoVE על איך לתרבות ולהבדיל תאי גזע עובריים. כעת אתה צריך לדעת אילו גורמים חשובים לשמירה על תאי ES במצבם הלא מוערה, וכיצד אנו יכולים לנצל את pluripotency תא ES כדי ליצור סוגי תאים ספציפיים בצלחת. בהמשך, מדענים יפעלו לפיתוח תנאי פולחן ובידול יעילים ומוגדרים היטב כדי לייצר סוגי תאים מיוחדים שניתן להשתמש בהם ביישומי רפואה רגנרטיבית. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter