Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Developmental Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

השראה Pluripotency

Overview

תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSCs) הם תאים סומטיים שתוכנתו מחדש גנטית ליצירת תאי גזע לא מובחנים. כמו תאי גזע עובריים, ניתן לגדל IPSCs בתנאי תרבות המקדמים בידול לסוגי תאים שונים. לפיכך, IPSCs עשוי לספק מקור בלתי מוגבל פוטנציאלי של כל סוג תא אנושי, המהווה פריצת דרך משמעותית בתחום הרפואה המתחדשת. עם זאת, עדיין יש צורך במחקר נוסף על הנגזרות וההבחנה של IPSCs כדי להשתמש בתאים אלה בפועל קליני.

וידאו זה מציג תחילה את העקרונות הבסיסיים מאחורי תכנות מחדש של התא, ולאחר מכן מדגים פרוטוקול ליצירת IPSCs מפיברובלסטים עובריים מובחנים של עכברים. לבסוף, הוא ידון במספר ניסויים שבהם מדענים משפרים או מיישמים טכניקות של ייצור IPSC.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תאי גזע פלוריפוטנטים מושרים, כמו תאי גזע עובריים אנושיים, יכולים להתבדל כמעט לכל תא בגוף, ולכן מחזיקים בהבטחה גדולה בתחום הרפואה המתחדשת.

תאי גזע עובריים אנושיים, או hESCs, מתקבלים מעוברים טרום ההשתלה, בעוד תאים סומטיים מובחנים לחלוטין משמשים ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים, המכונים גם IPSCs.

בסרטון וידאו זה, אתה הולך ללמוד על העקרונות הבסיסיים מאחורי יצירת iPSCs, פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לגרום pluripotency בתאים מובחנים, וכמה יישומים במורד הזרם הרב ושינויים של פרוטוקול זה.

נתחיל בדיון על העקרונות שמאחורי יצירת IPSCs מסוגי תאים סומטיים.

תאים מובחנים, כמו תאי עור או נוירונים, הם אלה שגורלם נקבע. הם מחויבים לבצע פונקציה מסוימת. מצד שני, תאי גזע פלוריפוטנטים הם אלה שגורלם אינו מוצהר, והם יכולים להבדיל לכל סוג של תא.

תהליך שינוי הזהות של תא שכבר מובחן למצב פלוריפוטנטי נקרא תכנות מחדש של תאים. זה כרוך בשינוי התבנית של ביטוי גנים בתא, כי מספר וסוגי החלבונים המיוצרים על ידי תא ממלאים תפקיד מרכזי בהגדרת זהות התא.

אחת הדרכים לגרום לתכנות מחדש של התאים היא על ידי גרימת הביטוי של גורמי שעתוק מסוימים. גורמי שעתוק הם חלבונים שנקשרים לרצפים רגולטוריים בתוך גן. חלק מהרצפים האלה נקראים "מקדמים", ולכן מקדמים שעתוק של גן. כמה גורמי שעתוק יכולים להשפיע על הביטוי של גנים רבים, אשר יש השפעה עצומה על זהות התא.

ארבעת גורמי התמלול הקלאסיים שהוכחו כגורם לפלוריפוטנס הם אוקטובר4, סוקס2, cMyc ו- Klf4. גורמים אלה ידועים גם כגורמי ימאנאקה, על שם החוקר שגילה את השפעות התכנות מחדש שלהם.

ניתן להשתמש בשיטות מרובות כדי לגרום לביטוי של גורמי שעתוק אלה. השיטה הנפוצה והיעילה ביותר היא שימוש בווירוס מותאם כדי להעביר את הגנים של גורם התמלול לגרעין, שם הם ישתלבו בגנום.

בשיטה זו, הגנים המקודדים את ארבעת גורמי ימאנאקה נארזים בנפרד לרטרווירוסים שונים ומתווספים לתאים מובחנים. כאשר התאים נחשפים לווירוסים שהשתנו, חלק קטן מהתאים המובחנים נדבקים בכל ארבעת הווירוסים הנושאים גורמי שעתוק. הם מתחילים להתפזר עד שנוצרים אשכולות כדוריים גדולים של תאי גזע פלוריפוטנטים. היווצרות האשכול מסייעת ל- IPSCs ליצור מיקרו-סביבה הדומה לתאי גזע ב- vivo, ולכן מסייעת להם לשמור על הפלוריפוטנס שלהם.

מכיוון שכעת אתם מבינים את העקרונות הבסיסיים מאחורי הדור של IPSCs, בואו נעבור על פרוטוקול כללי לזירוז פלוריפוטנס בפיברובלסטים עובריים של עכברים, או MEFs, באמצעות מערכת טרנסדוקציה ויראלית.

לפני תחילת הליך זה, שים לב כי וירוסים יכולים להדביק את התאים בגוף שלך, ולכן ביצוע הנחיות בטיחות חשוב מאוד.

כדי להתחיל את תהליך הטרנס-זיהום, מדיום התרבות מוסר מצלחת המכילה צפיפות גבוהה של MEFs, והתאים נשטפים עם תמיסת חיץ. לאחר מכן, תמיסה המכילה אנזים משפיל חלבון, כמו טריפסין, מתווספת להרים את התאים מתחתית המנה. לאחר מכן מתווסף למדיום התרבותי לצלחת, והתאים המנותקים מועברים לצינור צנטריפוגה.

לאחר צנטריפוגה, הכדור מושעה מחדש במדיום התרבותי. לאחר מכן, התאים נספרים והריכוז מותאם כך שמספר אופטימלי של תאים יכול להיות נגוע בווירוס למחרת. לדגור על התאים בן לילה.

לאחר שהתאים התיישבו על המנה החדשה שלהם, המדיה הישנה מוחלפת במדיה טרייה, ווירוסים מהונדסים המכילים את גורמי התמלול הרצויים מתווספים לצלחת. לאחר מכן התאים דוגרים בווירוסים לזמן מספיק כדי לאפשר לזיהום להתרחש. לאחר הדגירה, המדיום המכיל וירוסים חופשיים מוסר ומוחלף במדיום תאי גזע עובריים טריים.

במשך 2-3 שבועות לאחר טרנספורמציה, התאים צריכים לגדול ב 37 ° באינקובטור, ואת מדיה התרבות צריך להיות מוחלף מדי יום.

לאחר פרק זמן זה, מושבות IPSC שנראות דומות למושבות תאי גזע עובריות צריכות להיות גדולות מספיק כדי להיות נאספים. המושבות ניתן להעביר ללוח טרי המכיל בינוני עם גורמי גדילה מתאימים, ומאפשר לגדול עוד יותר. על מנת לאשר pluripotency, חלק מאוכלוסיית התא מוכתם עם סמני pluripotency.

כעת, לאחר שראית כיצד ליצור IPSCs מתאים מובחנים, בואו נסתכל על כמה יישומים במורד הזרם ושינויים בשיטה שימושית זו.

תכונה חשובה של iPSCs היא שהם יכולים לשמש כדי ליצור כמעט כל תא בגוף. דוגמה זו מציגה דור של תאי שריר הלב, הנקראים cardiomyocytes, מ- IPSCs. על מנת לעשות זאת, IPSCs מועברים לוחות שאינם דבקים המאפשרים להם ליצור גופים עובריים, שהם אגרגטים של תאי גזע פלוריפוטנטים. גופי העובר מתורבתים במדיום מיוחד המכיל סרום וחומצה אסקורבית, אשר משפר את ההבחנה הלבבית. הבחנה מוצלחת ניתן לראות בקלות כאשר תאים מסוימים מתחילים לנצח.

מכיוון ש- iPSCs יכול להבדיל באופן פוטנציאלי לכל סוג תא, הם יכולים גם ליצור אורגניזם שלם, כמו עכבר. זה יכול להיעשות באמצעות מבחן שנקרא תטרפלואיד משלים. ראשית, עובר טטרפלואידי, עובר המכיל ארבעה סטים של כרומוזומים, נוצר על ידי היתוך שני תאים של עובר מוקדם יחד באמצעות שדה חשמלי. העובר הטטרפלואידי רשאי להתפתח לשלב הפיצוץ. IPSCs מוזרקים לאחר מכן לתוך blastocyst, אשר מושתל לאחר מכן לתוך נקבה נמען להריון. התאים הטטרפלואידים מסוגלים ליצור רק מבנים חוץ-מביריים כמו השליה, כך שבעלי חיים הנובעים משיטה זו נגזרים לחלוטין מ- IPSCs.

חלק מהחוקרים משנים את הליך התכנות מחדש כדי להפוך את תהליך הזיהוי של תאים שתוכנו מחדש בהצלחה ליעיל יותר. לדוגמה, בניסוי זה MEFs עם היכולת לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק בהשפעת מקדם Oct4 עזר לחוקרים לזהות בקלות תאים שרכשו pluripotency.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על יצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. סרטון וידאו זה סקר את העקרונות העומדים מאחורי הליך זה, ופרוטוקול שלב אחר שלב ליצירת IPSCs מתאים מובחנים. בדקנו גם כיצד ניתן ליישם או לשנות שיטה זו לניסויים במעבדה.

לגילוי של IPSCs יש השפעה עצומה על תחום הביולוגיה של תאי הגזע, שכן יש לו פוטנציאל עצום לפיתוח טיפולים שניתן להשתמש בהם לטיפול בהפרעות ניווניות. למרות התקדמות רבה נעשתה עם IPSCs, המשוכה שעדיין צריך לחצות היא הסיכון הקשור לסרטן. הליכי התכנות מחדש הנוכחיים יש פוטנציאל לגרום צמיחת תאים ללא פיקוח שעלול לגרום לסרטן. לכן, דרוש מחקר נוסף כדי להשתמש ב- iPSCs מבחינה קלינית. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter