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Developmental Biology

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Mapeamento do Destino

Overview

O mapeamento do destino é uma técnica usada para entender como as células embrionárias se dividem, diferenciam e migram durante o desenvolvimento. Em experimentos clássicos de mapeamento do destino, as células em diferentes áreas de um embrião são rotuladas com um corante químico e, em seguida, rastreadas para determinar quais tecidos ou estruturas eles formam. As melhorias tecnológicas agora permitem que células individuais sejam marcadas e traçadas ao longo do desenvolvimento embrionário e da idade adulta.

Este vídeo revisa os conceitos por trás do mapeamento do destino e, em seguida, detalha um protocolo de mapeamento do destino em zebrafish usando proteínas fluorescentes fotoativas. Finalmente, são discutidas aplicações específicas e modificações desta técnica única.

Procedure

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Biólogos do desenvolvimento usam o mapeamento do destino como uma ferramenta para rastrear linhagens celulares enquanto um organismo amadurece. Isso é feito rotulando células em um estágio embrionário e, em seguida, rastreando-as e sua descendência durante todo o desenvolvimento do organismo. O mapeamento de destinos também é usado para estudar a migração celular e a diferenciação durante o desenvolvimento, bem como a regeneração e reparação durante a vida adulta.

Este vídeo fornecerá uma visão geral do mapeamento do destino, explicará um protocolo usado para gerar um mapa do destino em zebrafish, e mostrará algumas maneiras pelas quais essa técnica está sendo aplicada em laboratórios.

Antes de entrar nos detalhes processuais, vamos discutir o que é um mapa do destino e como ele é construído.

Em experimentos clássicos de mapeamento do destino, os cientistas mancharam grupos de células em um embrião inicial, como os do estágio gastrula, com um corante que seria passado para todos os descendentes dessas células. Depois de permitir que o embrião se desenvolvesse por um determinado período de tempo, eles viram as células manchadas no organismo mais maduro. A localização de células manchadas no organismo maduro foi então notada. Resultados agrupados de vários experimentos semelhantes permitiram a construção de um diagrama conhecido como mapa do destino.

Portanto, um mapa do destino é um plano global que descreve o destino de cada parte de um embrião precoce. Esses mapas ajudam os cientistas a determinar coisas como quais células embrionárias se diferenciam em quais células adultas funcionais e como migram e se organizam em estruturas maduras.

Cientistas têm usado muitos organismos modelo para criar mapas do destino, incluindo sapos, nematoides, peixes, filhotes e ratos. Alguns organismos modelo, como o zebrafish Danio rerio,têm uma vantagem adicional nesse tipo de experimento. Como são pequenos e permanecem transparentes durante grande parte do processo de desenvolvimento, os cientistas podem facilmente rastrear as células vendo os peixes sob um microscópio leve. É importante ressaltar que os avanços nas técnicas de rotulagem celular agora permitem que os cientistas marquem com precisão células únicas e as rastreiem à medida que o organismo se desenvolve, o que ajuda na criação de um mapa de destino extremamente detalhado.

Agora que você tem uma ideia sobre o que são mapas do destino, vamos discutir um protocolo para mapeamento do destino em zebrafish que usa fotoativação. Esta abordagem relativamente nova depende de proteínas fotoativas. São proteínas fluorescentes especiais, que são "enjauladas", o que significa que são mantidas em uma conformação específica para evitar a fluorescência. A aplicação de um pulso laser controlado causa uma alteração conformacional, chamada de "uncaging", que resulta em fluorescência visível.

Para realizar este experimento, essas proteínas enjauladas especializadas são primeiro sintetizadas e depois injetadas em um ou dois embriões de zebrafish estágio celular. Em seguida, os embriões podem amadurecer até o estágio de desenvolvimento desejado antes da fotoativação.

Em seguida, para preparar o peixe para fotoativação, os embriões são descorrioados para tornar o tecido alvo acessível. Em seguida, eles são montados em um meio opticamente claro, como a baixa temperatura de fusão agarose, que os mantém com segurança em uma posição estável. As amostras estão alinhadas para expor a área de interesse, e montadas em um microscópio equipado com laser. Um pulso laser é aplicado na área alvo contendo células de interesse, induzindo a fotoativação.

Após o tratamento a laser, os embriões são cuidadosamente removidos da agarose e devolvidos ao seu ambiente natural até que o estágio de desenvolvimento desejado seja alcançado. Para rastrear as células fotoativadas, os embriões são novamente incorporados em baixa temperatura de fusão, e as células fotoativadas podem então ser visualizadas e rastreadas usando fluorescência direta ou imunostaining.

Agora que você tem uma compreensão geral de um protocolo de mapeamento do destino, vamos dar uma olhada em alguns experimentos de laboratório que se aproveitam deste procedimento.

Além de estudar o desenvolvimento embrionário, o mapeamento do destino pode ser usado para examinar o reparo em sistemas maduros. Neste experimento, um subtipo celular específico foi ablado de uma retina de zebrafish transgênico. Os cientistas então rastrearam células-tronco adultas geneticamente rotuladas para determinar seu destino após a lesão. Por fim, foi realizada a análise da imagem, que demonstrou ativação de células-tronco adultas e posterior reparação tecidual.

Os cientistas também estão usando protocolos semelhantes para entender os destinos das células-tronco transplantadas. Aqui, células-tronco embrionárias humanas geneticamente marcadas, ou hESCs, foram transplantadas em um modelo de camundongo imunocomprometido. As células implantadas foram autorizadas a diferenciar-se por 8-12 semanas, após a qual o teratoma resultante, que é um tumor que contém tecido de múltiplas camadas germinativas, foi colhido, fixo e imunossundo para determinar o destino das células-tronco implantadas. Esse tipo de experimento ajuda os cientistas a confirmar o potencial in vivo diferenciativo das células-tronco cultivadas.

Como mencionado anteriormente, os cientistas realizam procedimentos de mapeamento do destino em vários organismos modelo, incluindo mamíferos. Neste estudo em particular, os cientistas marcaram células em uma região específica de um embrião de camundongos precoce usando abordagens genéticas indutíveis. Isso é feito administrando um agente indutor a um rato grávida que carrega descendentes geneticamente modificados. As células rotuladas foram rastreadas ao longo de estágios de desenvolvimento posteriores, o que ajudou os cientistas a determinar seu destino final.

Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre o mapeamento do destino. Este vídeo forneceu algumas informações sobre a criação de mapas de destino, revisou um protocolo específico de mapeamento do destino e discutiu algumas das modificações e aplicações desta técnica extremamente útil. Como sempre, obrigado por assistir!

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