减数分裂是一种独特的分裂过程，发生在配子（卵母细胞和精子）中，包括两次连续的分裂，其间不发生DNA合成，分别在减数分裂I和减数分裂II中分离同源染色体和姐妹染色单体1。卵母细胞减数分裂过程中染色体分离错误可导致非整倍体，这种异常会在受精时遗传给胚胎。值得注意的是，随着母亲年龄的增长，发育中胚胎的非整倍体发生率增加，这是女性先天性出生缺陷和妊娠丢失的主要原因1,2，因此凸显了深入理解减数分裂过程中非整倍体分子基础的重要需求。

细胞分裂过程中，染色体的正确分离高度依赖于微管纺锤体结构的组装以及染色体与微管之间稳定相互作用的建立，以确保染色体正确连接至纺锤体的两极。重要的是，哺乳动物卵母细胞中的减数分裂纺锤体形成不同于体细胞的有丝分裂，其由缺乏中心粒的独特微管组织中心（MTOC）所调控3,4。对于微管成核和组织至关重要的蛋白质定位于卵母细胞的MTOC，其中包括催化微管组装的γ-微管蛋白。此外，pericentrin作为一种关键的支架蛋白，在MTOC处结合并锚定γ-微管蛋白及其他相关因子5。值得注意的是，我们的研究表明，关键MTOC相关蛋白的缺失会破坏卵母细胞中减数分裂纺锤体的正常组织，并导致染色体分离错误，而此类错误无法被纺锤体组装检验点（SAC）完全识别和纠正6,7。因此，那些不足以触发减数分裂阻滞的纺锤体稳定性缺陷，仍会显著增加非整倍体发生的风险。尽管MTOC在纺锤体组装与组织中具有关键作用，但卵母细胞MTOC的蛋白质组成及其功能仍知之甚少。

在哺乳动物卵母细胞中检测特定靶蛋白功能具有挑战性，因为这些细胞在减数分裂恢复前不久即进入转录静止状态8,9。因此，排卵前的卵母细胞依赖母源性mRNA储存来恢复减数分裂，并支持减数分裂以及受精后的首次卵裂分裂10,11。RNA干扰（RNAi）介导的mRNA转录本降解在哺乳动物卵母细胞中的有效性已得到充分证实，且在减数成熟过程中被招募进行翻译的母源RNA特别易于被siRNA靶向12-14。因此，将短干扰RNA（siRNA）显微注射至卵母细胞中，为耗竭靶mRNA以进行功能检测提供了一种有效的方法。

本文介绍了分离小鼠卵母细胞以及利用siRNA介导的转录本敲低技术来检测中心体周围蛋白（pericentrin）这一关键MTOC相关蛋白功能的方法。此外，还描述了用于评估卵母细胞中减数分裂纺锤体形成的免疫荧光分析条件。

本实验的总体目标是评估在通过irna介导耗竭关键MTOC相关蛋白（如perrin）后，Cytes中纺锤体的形成与组织情况。该方法有助于回答生殖生物学领域中的一些关键问题，例如调控染色体分离的机制以及导致各时期非整倍体发生的潜在干扰因素。该技术的主要优势在于能够实现高效的转录本敲低，并对单个Cytes进行特异性的免疫荧光分析。

该操作方案还可进行调整，用于研究几乎所有目标蛋白。在收集日的48小时前，对用于卵母细胞采集的雌性小鼠腹腔注射5个国际单位的PMSG。采用标准操作收集卵巢后，将其转移至含有预热平衡的MEM培养基的培养皿中，该培养基需添加BSA和mil reone，并准备在体视显微镜下分离卵母细胞。使用27号针头将卵巢固定在培养皿底部，再用另一根针头穿刺窦状卵泡，通过卵母细胞抽吸或标准的口控移液操作释放卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。

收集被两层或更多层致密卵丘细胞包围的卵母细胞。将这些卵丘-卵母细胞复合体（COCs）转移至含有M-E-M-B-S-A mild reone的新培养皿中，在37摄氏度下孵育1小时。随后采用标准方法对卵母细胞进行去丘处理。

在注射培养皿中加入三毫升含有每毫升一微克米洛宁的M2培养基。同时，用M-E-M-B-S-A米洛宁准备洗涤和培养用的培养皿。接着，将五微升一毫摩尔的INA溶液吸入注射针中，并准备好进行显微注射。

现在，在一个3厘米培养皿的盖子上放置一滴100微升的M2培养基。将一个卵母细胞加入液滴中，并利用它调整持卵管的位置。通过负压将OAS装置固定在持卵管上，以确保其位置稳定。

然后将注射针调整至卵母细胞最大直径的位置。定位后，向卵母细胞的细胞质中注入约10皮升溶液，避免刺入细胞核。将培养皿盖放回体视显微镜载物台上，并加入100微升新鲜的M2培养基。

将约10个细胞放入培养基中。然后在显微注射台上进行显微注射操作。用持卵管固定每个卵母细胞，缓慢将注射针插入细胞质中。

注入S irna溶液，并小心地撤回注射移液管。将注射成功的细胞移至液滴的一端，将注射失败的细胞移至液滴的另一端。注射10个细胞仅需几分钟，这对于维持细胞活性至关重要。

将盖玻片移至体视显微镜载物台上，并将所有成功注射的细胞转移至含有M-E-M-B-S-A Mel的培养皿中，置于37摄氏度条件下。将细胞转移至含有医用气体环境的37摄氏度培养箱中，孵育24小时。首先通过用M-E-M-B-S-A洗涤细胞三次，从mil reone块中释放细胞。

然后将细胞转移至含有10% FBS的成熟培养基中，在37°C条件下培养17小时，以便次日恢复减数分裂。

固定细胞。使用细胞吸取法或口吸移液法，迅速将不同实验组的细胞转移至含有750 µL预热的4% PFA的4孔板各孔中。室温孵育1小时。

每组用750微升含5%FBS的预热PBS洗涤三次。每次洗涤后，在培养箱中孵育15分钟。每个O位点组用含5%FBS