La meiosis es un proceso de división único que ocurre en gametos (ovocitos y espermatozoides) y consiste en dos divisiones sucesivas sin intervenir la síntesis de ADN para segregar los cromosomas homólogos y cromátidas hermanas durante la meiosis I y meiosis II, respectivamente 1. Los errores en la segregación cromosómica durante la división meiótica en ovocitos pueden dar lugar a aneuploidía, que se hereda por el embrión durante la fertilización. En particular, la incidencia de la aneuploidía en embriones en desarrollo aumenta con el avance de la edad materna y es una causa importante de defectos congénitos, así como la pérdida del embarazo en mujeres 1,2, por lo tanto, lo que subraya una importante necesidad de comprender la base molecular de la aneuploidía durante la división meiótica .
Durante la división celular, la segregación cromosómica depende crucialmente de montaje del huso mitótico microtúbulos y el establecimiento de interacciones del cromosoma microtúbulos estables para el correcto apego a husillo opuestopolos. Es importante destacar que la formación del huso meiótico en ovocitos de mamíferos difiere de la mitosis en las células somáticas, y está regulado por los centros de organización de microtúbulos (COMT) únicas que carecen de centriolos 3,4. Proteínas esenciales necesarios para la nucleación de microtúbulos y organización localizar a COMT ovocitos, incluyendo γ-tubulina que cataliza ensamblaje de los microtúbulos. Además, pericentrina funciona como un andamio de proteínas esenciales, que se une y anclajes gamma-tubulina, así como otros factores en COMT 5. En particular, nuestros estudios demuestran que el agotamiento de las proteínas asociadas-MTOC clave interrumpe organización huso meiótico y conduce a errores en la segregación cromosómica ovocitos, que no se resuelven por completo por el punto de control de ensamblaje del huso (SAC) 6,7. Por lo tanto, los defectos en la estabilidad del huso, que no provocan la detención meiótica, plantean un riesgo significativo para contribuir a la aneuploidía. A pesar de su papel esencial en el montaje y organización del huso, prot MTOC ovocitocomposición y función ein sigue siendo poco conocida.
Prueba de la función de las proteínas diana específicas en ovocitos de mamíferos es un reto, ya que las células se vuelven transcripcionalmente inactiva poco antes de la reanudación de la meiosis 8,9. Por lo tanto, los ovocitos pre-ovulatorios se basan en tiendas de mRNA maternos para reanudar la meiosis y apoyan la división meiótica, así como las primeras divisiones de escisión después de la fertilización 10,11. La eficacia de la interferencia de ARN (RNAi) mediada por la degradación de transcritos de ARNm en ovocitos de mamíferos está bien establecido y RNAs maternas reclutados para la traducción durante la maduración meiótica son particularmente susceptibles de siRNA dirigidos 12-14. Por lo tanto, la microinyección de RNAs de interferencia cortos (siRNAs) en oocitos proporciona un enfoque valioso para agotar los ARNm diana para el ensayo funcional.
A continuación, describimos los métodos para el aislamiento de los ovocitos de ratón y el agotamiento de siRNA mediada por transcri específicapts para probar la función de una proteína esencial asociada a MTOC, pericentrina. Además, se describen condiciones de análisis de inmunofluorescencia para evaluar la formación del huso meiótico en ovocitos.
El objetivo general de este procedimiento es evaluar la formación y organización del huso mitótico en células tras el agotamiento mediado por ARNi de proteínas clave asociadas al MTOC, como la perrina. Este método puede ayudar a responder preguntas fundamentales en el campo de la biología reproductiva, tales como los mecanismos que regulan la segregación cromosómica y las posibles alteraciones que conducen a la aneuploidía en todos los sitios. La principal ventaja de esta técnica es que permite un silenciamiento eficiente de transcritos y un análisis específico mediante inmunofluorescencia de células individuales.
Este procedimiento también puede adaptarse para estudiar casi cualquier proteína diana; 48 horas antes del día de recolección, tratar las ratonas utilizadas para la recolección de ovocitos con cinco unidades internacionales de PMSG inyectadas por vía intraperitoneal. Después de recolectar los ovarios siguiendo prácticas estándar, transferirlos a una placa con medio MEM precalentado y equilibrado, suplementado con BSA y mil reona, y preparar el aislamiento de los ovocitos bajo un microscopio estereoscópico. Liberar los complejos de cito con cumulus o COCs fijando un ovario