מיוזה היא תהליך החלוקה ייחודי המתרחש בתאי מין (ביציות וזרע) וכולל שתי חטיבות רצופות ללא התערבות סינתזת DNA להפריד כרומוזומים הומולוגיים וchromatids האחות במהלך מיוזה-אני ומיוזה-השנייה, בהתאמה 1. שגיאות בהפרדת כרומוזום במהלך חלוקת meiotic בביציות יכולות לגרום aneuploidy, שעובר בירושה על ידי העובר במהלך הפריה. יש לציין, השכיחות של aneuploidy בעוברים מתפתחים עולה עם עלייה בגיל האם והיא אחד גורמים עיקריים למומים מולדים, כמו גם אובדן הריון בנשים 1,2, וכך, מדגיש את הצורך חשוב להבין את הבסיס המולקולרי של aneuploidy במהלך חלוקת meiotic .
במהלך חלוקת תא, הפרדה כרומוזום היא מכריע תלויה בהרכבה של מנגנון ציר microtubule והקמה של אינטראקציות כרומוזום-microtubule יציבה עבור התקשרות נכונה לציר הפוךקטבים. חשוב לציין, היווצרות ציר meiotic בביציות של יונקים שונים ממיטוזה בתאים סומטיים, ומוסדרת על ידי מרכזי ארגון-microtubule הייחודיים (MTOCs) שחסרי centrioles 3,4. חלבונים חיוניים נחוצים להתגרענות microtubule וארגון למקם לMTOCs ביצית, כולל γ טובולין שמזרז הרכבה microtubule. בנוסף, pericentrin פונקציות כמו חלבון פיגומים חיוני, אשר נקשר ועוגני γ טובולין, כמו גם גורמים אחרים בMTOCs 5. יש לציין, המחקרים שלנו מראים כי דלדול של חלבונים הקשורים-MTOC מפתח משבש ארגון ציר meiotic ומוביל לשגיאות הפרדת כרומוזום בביציות, שאינם מלא נפתרו על ידי מחסום ההרכבה ציר (SAC) 6,7. לכן, פגמים ביציבות ציר, שאינו מפעילים את מעצר meiotic, מהווים סיכון משמעותי בתרומה לaneuploidy. למרות התפקיד החיוני שלהם בהרכבת ציר וארגון, prot MTOC הביציתהרכב עין ותפקוד נשאר הבינו היטב.
בדיקת תפקודם של חלבוני יעד ספציפיים בביציות יונקים היא מאתגרת, כמו התאים להפוך לתעתיק שקטים זמן קצר לפני חידוש מיוזה 8,9. לפיכך, ביציות מראש ביוץ להסתמך על חנויות mRNA אימהיות לחדש מיוזה ותומכות בחלוקה meiotic כמו גם חטיבות המחשוף הראשונות לאחר ההפריה 10,11. היעילות של התערבות RNA השפלה (RNAi) בתיווך של תעתיקי mRNA בביציות יונקים היא מבוססת היטב וRNAs האימהי גויס לתרגום במהלך התבגרות meiotic במיוחד נוח לsiRNA מיקוד 12-14. לכן, microinjection של RNAs התערבות הקצר (siRNAs) לביציות מספק גישה רבת ערך לרוקן mRNAs היעד לבדיקה פונקציונלית.
כאן אנו מתארים שיטות לבידוד של ביציות עכבר ודלדול בתיווך siRNA של transcri הספציפינק 'כדי לבדוק את התפקוד של חלבון הקשורים MTOC חיוני, pericentrin. בנוסף, אנו מתארים תנאי ניתוח immunofluorescence להעריך היווצרות ציר meiotic בביציות.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את ההיווצרות והארגון של כישורי המיטוזה בציטטים בעקבות דהרגה (depletion) מתווכת irna של חלבונים מרכזיים הקשורים ל-MTOC, כגון perrin. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה הרבייתית, כגון המנגנוים המווסתים את הפרדת הכרומוזומים ושיבושים פוטנציאליים המובילים לאנויפלואידיה בכל האתרים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מובילה ל-knockdown יעיל של התמלול ולניתוח אימונופלואורסצנציה ספציפי של ציטטים בודדים.
ניתן להתאים פרוצדורה זו לחקר של כמעט כל חלבון מטרה. 48 שעות לפני יום האיסוף, יש לטפל בעכברים הנקבות המשמשים לאיסוף ציותים על ידי הזרקה תוך-בטנית של חמישה יחידות בינלאומיות של PMSG. לאחר איסוף השחלות בשיטות סטנדרטיות, העבירו אותן לצלחת עם מצע MEM המחומם מראש ומוסב, המועשר ב-BSA וב-mil reone, והכינו את השטח לבידוד הציותים תחת מיקרוסקופ דיסקציה. שחררו את קומפלקס הציטית-קומיולוס (COCs) על ידי קיבוע השחלה לתחתית צלחת התרבית באמצעות מחט במידה 27, והשתמשו במחט שנייה כדי לנקב את הזקיקים האנטרליים באמצעות שאיבת ציותים או שיטת פיפטינג פה סטנדרטית.
אספו את התאים הביצתיים (oocytes) המוקפים בשתי שכבות או יותר של תאי cumulus דחוסים. העבירו COCs אלו לצלחית חדשה המכילה M-E-M-B-S-A mild reone והדגירו אותם למשך שעה בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, המשי