La meiosi è un processo di divisione unica che si verifica in gameti (ovociti e spermatozoi) e coinvolge due divisioni successive senza intervenire sintesi del DNA per separare i cromosomi omologhi e cromatidi fratelli durante la meiosi I e meiosi II, rispettivamente, 1. Errori nella segregazione dei cromosomi durante la divisione meiotica in oociti possono causare aneuploidia, che viene ereditato dalla embrione durante la fecondazione. In particolare, l'incidenza di aneuploidie negli embrioni in via di sviluppo aumenta con l'avanzare dell'età materna, ed è una delle principali cause di difetti di nascita congeniti così come la perdita di gravidanza nelle donne 1,2, quindi, sottolineando l'importante necessità di comprendere le basi molecolari di aneuploidie durante la divisione meiotica .
Durante la divisione cellulare, la segregazione dei cromosomi è strettamente dipendente dalla assemblea degli apparati microtubuli fuso e la creazione di interazioni stabili cromosomiche-microtubuli per un corretto attaccamento al mandrino oppostopali. È importante sottolineare che la formazione del fuso meiotico in ovociti di mammiferi si differenzia da mitosi nelle cellule somatiche, ed è regolata da centri-microtubuli organizzare unici (MTOC) che mancano centrioli 3,4. Proteine essenziali necessari per microtubuli nucleazione e di organizzazione localizzano a MTOC ovociti, tra cui γ-tubulina che catalizza dei microtubuli. Inoltre, pericentrin funziona come una proteina essenziale impalcature, che lega e ancoraggi gamma-tubulina, nonché altri fattori in MTOC 5. In particolare, i nostri studi dimostrano che la deplezione delle proteine MTOC associate chiave interrompe organizzazione fuso meiotico e porta ad errori cromosoma segregazione in ovociti, che non sono completamente risolti con il checkpoint del fuso (SAC) 6,7. Pertanto, difetti di stabilità mandrino, che non attivano l'arresto meiotica, presentano un rischio significativo nel contribuire a aneuploidie. Nonostante il loro ruolo essenziale per il montaggio del mandrino e organizzazione, prot ovociti MTOCcomposizione e la funzione ein rimane poco compresa.
Testare la funzione di specifiche proteine bersaglio negli ovociti di mammiferi è impegnativo, in quanto le cellule diventano trascrizionalmente quiescenza poco prima della ripresa della meiosi 8,9. Quindi, ovociti pre-ovulatori si affidano a negozi mRNA materni per riprendere la meiosi e sostenere divisione meiotica così come le prime divisioni scissione dopo la fecondazione 10,11. L'efficacia di RNA interference (RNAi) la degradazione mediata di trascritti di mRNA negli ovociti di mammiferi è ben consolidata e RNA materni reclutati per la traduzione durante la maturazione meiotica sono particolarmente suscettibili di siRNA targeting per 12-14. Pertanto, la microiniezione di brevi RNA interferenti (siRNA) in ovociti offre un valido approccio per esaurire mRNA bersaglio per i test funzionali.
Qui, descriviamo i metodi per l'isolamento di ovociti di topo e di siRNA mediata esaurimento delle transcri specificopts per testare la funzione di una proteina essenziale MTOC-associata, pericentrin. Inoltre, si descrivono le condizioni di analisi di immunofluorescenza per valutare la formazione del fuso meiotico in ovociti.
L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la formazione e l'organizzazione del fuso mitotico in cellule dopo l'abbattimento mediato da irna di proteine chiave associate ai MTOC, come la perrina. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia riproduttiva, come i meccanismi che regolano la segregazione dei cromosomi e le possibili alterazioni che portano all'aneuploidia in tutti i siti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un efficace silenziamento trascrizionale e un'analisi immunofluorescente specifica delle singole cellule.
Questa procedura può essere adattata anche per lo studio di quasi ogni proteina bersaglio. 48 ore prima del giorno di raccolta, trattare le topoline utilizzate per la raccolta degli ovociti con cinque unità internazionali di PMSG iniettate per via intraperitoneale. Dopo aver raccolto le ovaie utilizzando pratiche standard, trasferirle in una piastra contenente mezzo MEM preriscaldato ed equilibrato, integrato con BSA e mil reone, e procedere all'isolamento degli ovociti sotto un microscopio stereoscopico. Rilasciare i complessi citofollicolari o COC fissando un'ovaia al fondo della piastr