감수 분열은 생식 세포 (난자와 정자)에서 발생하고 감수 분열-I 및 감수 분열-II, 각각 1시 상동 염색체와 자매 염색 분체를 분리하는 DNA 합성을 개입하지 않고 두 개의 연속 부문을 포함하는 고유의 분할 과정이다. 난자의 감수 분열시 염색체 분리의 오류 수정시 배아 상속 이수성,이 발생할 수 있습니다. 특히, 개발 배아의 염색체의 발생률은 산모의 나이 발전과 함께 증가하고 여성 1,2 임신 손실뿐만 아니라 선천성 기형아 출산의 주요 원인이며, 따라서, 감수 분열시 염색체의 분자 기초를 이해하는 중요한 필요성을 강조 .

세포 분열시 염색체 분리 반대 스핀들에 올바른 부착에 대한 미세 소관 스핀들 장치 및 안정적인 염색체 미세 소관의 상호 작용의 설립의 조립에 결정적으로 의존극. 중요한 것은, 포유 동물 난자의 감수 스핀들 형성은 체세포에서 유사 분열과 다른, 독특한 미세 소관 조직 센터 중심 소체 3,4 부족 (MTOCs)에 의해 조절된다. 미세 소관의 핵 및 조직에 필요한 필수 단백질은 미세 소관의 조립을 촉매 γ-tubulin에 포함 난자 MTOCs에 지역화. 또한,도 5에 결합 MTOCs 필수적인 비계 단백질로서 기능하고 앵커 γ-tubulin에뿐만 아니라 다른 요인 pericentrin. 특히, 우리의 연구는 키 MTOC 관련 단백질의 고갈이 감수 스핀들 조직을 방해 완전히 스핀들 조립 검사 점 (SAC) 6,7에 의해 해결되지 않은 난자의 염색체 분리의 오류에 이르게 것을 보여줍니다. 따라서, 감수 체포를 유발하지 않는 스핀들 안정성 결함은 염색체 이수성에 기여에 상당한 위험을 초래할. 스핀들 조립 및 조직, 난자 MTOC의 제자에서의 중요한 역할에도 불구하고EIN 구성과 기능을 제대로 이해 남아 있습니다.

곧 세포의 감수 분열 8,9 재개하기 전에 정지 될 전사적으로 포유류 난자 특정 표적 단백질의 기능을 시험하는 것은 도전적이다. 따라서, 사전 배란 된 난자는 감수 분열을 재개 모성 mRNA의 저장에 의존 감수 분열뿐만 아니라, 시비 10, 11 후 첫 번째 분열 부문을 지원합니다. 포유류의 난자에서 mRNA의 성적 증명서의 RNA 간섭 (RNAi의) 중재 저하의 효능은 잘 확립되어 감수 성숙하는 동안 번역 모집 산모의 RNA는 siRNA를가 12-14을 목표로, 특히 의무가 있습니다. 따라서, 난 모세포에 짧은 간섭 RNA를의 미세 주입 (siRNA를)은 기능 테스트를위한 대상의 mRNA를 고갈 가치있는 접근 방법을 제공합니다.

여기, 우리는 마우스 난자 특정 transcri의 siRNA를 매개 고갈의 분리를위한 방법을 설명PTS는 pericentrin, 필수 MTOC 관련 단백질의 기능을 테스트합니다. 또, 난자의 감수 스핀들 형성을 평가하기 위해 면역 분석 조건을 설명한다.

이 절차의 전반적인 목표는 perrin과 같은 주요 MTOC 관련 단백질을 irna 매개로 결핍시킨 후, 세포 내의 방추사 형성 및 조직화를 평가하는 것입니다. 이 방법은 염색체 분리를 조절하는 메커니즘과 모든 부위에서 이배체 형성을 유발하는 잠재적 교란과 같이 생식 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 개별 세포에 대한 효율적인 전사 억제, 녹다운 및 특이적 면역형광 분석이 가능하다는 점입니다.

이 절차는 거의 모든 표적 단백질 연구에 맞게 조정될 수 있습니다. 난자 수집일 48시간 전에, 표준 방식으로 난소 수집에 사용할 암컷 마우스의 복강 내에 5 IU의 PMSG를 주입합니다. 수집한 난소를 BSA와 mil reone이 첨가되어 미리 데워지고 평형화된 MEM 배지가 담긴 디시에 옮긴 후, 해부 현미경 하에서 난자를 분리할 준비를 합니다. 27게이지 바늘을 사용하여 난소를 배양 디시 바닥에 고정하고, 두 번째 바늘로 난포강 난포를 천자하여 난자-적정세포 복합체(COC)를 방출시키는데, 이때 난자 흡입법 또는 표준 입-피펫팅 방식을 사용합니다.

두 층 이상의 조밀한 난포세포로 둘러싸인 난자를 수집합니다. 이 COC들을 M-E-M-B-S-A mild reone가 담긴 새 배양 접시로 옮기고 37°C에서 한 시간 동안 배양합니다. 그 후 표준 방법을 사용하여 난자의 난포세포 제거 과정을 진행합니다.

3 mL의 M2 배지에 1 µg/mL의 milone을 첨가하여 주입용 배양 접시를 준비합니다. 또한, 세척 및 배양용 접시를 M-E-M-B-S-A milone으로 준비합니다. 그 다음, 1 mM INA 용액 5 µL를 주입 바늘에 로딩하고 미세 주입을 위해 설정합니다.

이제 3cm 디시 뚜껑 위에 M two 배지 100 µL 한 방울을 떨어뜨립니다. 난자 하나를 해당 방울에 넣고, 이를 이용해 홀딩 피펫의 위치를 조정합니다. 음압을 이용하여 난자를 홀딩 피펫에 부착시켜 OAS 부위를 고정합니다.

그런 다음 주입 바늘의 위치를 난자의 가장 넓은 직경 부분으로 조정합니다. 위치가 잡히면 핵을 피해 난자 세포질에 약 10 picoliters의 용액을 주입합니다. 덮개를 스테레오 현미경 스테이지로 되돌리고 100 microliters의 신선한 M two 배지를 추가합니다.

약 10개의 난자를 배지에 넣습니다. 그 다음 마이크로인젝션 스테이지에서 마이크로인젝션을 진행합니다. 홀딩 피펫으로