Mejoza to unikalny proces podziału, który zachodzi w gametach (oocytach i plemnikach) i obejmuje dwa kolejne podziały bez ingerencji syntezy DNA w celu segregacji homologicznych chromosomów i chromatyd siostrzanych podczas mejozy-I i mejozy-II, odpowiednio1. Błędy w segregacji chromosomów podczas podziału mejotycznego w oocytach mogą skutkować aneuploidią, która jest dziedziczona przez zarodek podczas zapłodnienia. Warto zauważyć, że częstość występowania aneuploidii w rozwijających się zarodkach wzrasta wraz z wiekiem matki i jest główną przyczyną wrodzonych wad wrodzonych, a także utraty ciąży u kobiet1,2, co podkreśla ważną potrzebę zrozumienia molekularnych podstaw aneuploidii podczas podziału mejotycznego.
Podczas podziału komórki, segregacja chromosomów jest w decydującym stopniu zależna od montażu aparatu wrzeciona mikrotubuli i ustanowienia stabilnych interakcji chromosom-mikrotubula dla prawidłowego przyłączenia do przeciwległych biegunów wrzeciona. Co ważne, tworzenie wrzeciona mejotycznego w oocytach ssaków różni się od mitozy w komórkach somatycznych i jest regulowane przez unikalne centra organizujące mikrotubule (MTOC), które nie mają centrioli3,4. Niezbędne białka niezbędne do zarodkowania i organizacji mikrotubul lokalizują się w MTOC oocytów, w tym γ-tubulina, która katalizuje składanie mikrotubul. Ponadto perycentryna działa jako niezbędne białko rusztowania, które wiąże i zakotwicza γ-tubulinę, a także inne czynniki w MTOC5. Warto zauważyć, że nasze badania pokazują, że wyczerpanie kluczowych białek związanych z MTOC zakłóca organizację wrzeciona mejotycznego i prowadzi do błędów segregacji chromosomów w oocytach, które nie są w pełni rozwiązane przez punkt kontrolny składania wrzeciona (SAC)6,7. W związku z tym defekty stabilności wrzeciona, które nie powodują zatrzymania mejozy, stanowią znaczne ryzyko, przyczyniając się do aneuploidii. Pomimo ich zasadniczej roli w składaniu i organizacji wrzeciona, skład i funkcja białek MTOC oocytów pozostaje słabo poznana.
Testowanie funkcji specyficznych białek docelowych w oocytach ssaków jest wyzwaniem, ponieważ komórki stają się transkrypcyjnie spokojne na krótko przed wznowieniem mejozy8,9. W związku z tym oocyty przedowulacyjne polegają na matczynych zapasach mRNA, aby wznowić mejozę i wspierać podział mejotyczny, a także pierwsze podziały rozszczepienia po zapłodnieniu10,11. Skuteczność degradacji transkryptów mRNA w oocytach ssaków za pośrednictwem interferencji RNA (RNAi) jest dobrze znana, a matczyne RNA rekrutowane do translacji podczas dojrzewania mejotycznego są szczególnie podatne na siRNA ukierunkowane na 12-14. Dlatego mikroiniekcja krótkich interferujących RNA (siRNA) do oocytów stanowi cenne podejście do wyczerpania docelowych mRNA do testów funkcjonalnych.
Tutaj opisujemy metody izolacji mysich oocytów i pośredniczonego przez siRNA zubożenia określonych transkryptów, aby przetestować funkcję niezbędnego białka związanego z MTOC, perycentryny. Ponadto opisujemy warunki analizy immunofluorescencyjnej w celu oceny tworzenia wrzeciona mejotycznego w oocytach.
Ogólnym celem tej procedury jest ocena formowania i organizacji wrzeciona podziałowego w cytes po wyciszeniu za pomocą irna kluczowych białek związanych z MTOC, takich jak perrin. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozrodu, takie jak mechanizmy regulujące segregację chromosomów oraz potencjalne zaburzenia prowadzące do aneuploidii w obrębie wszystkich miejsc. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wydajny knockdown transkryptu oraz specyficzną analizę immunofluorescencyjną poszczególnych cytes.
Niniejszą procedurę można dostosować do badania niemal każdego białka docelowego. Na 48 godzin przed dniem zbioru potraktować samice myszy przeznaczonych do pobierania oocytów pięcioma jednostkami międzynarodowymi PMSG wstrzykniętymi domięśniowo. Po pobraniu jajników zgodnie ze standardowymi praktykami, przenieść je do naczynia z uprzednio ogrzanym, zrównoważonym medium MEM uzupełnionym o BSA i mil reone, a następnie przygotować się do izolacji oocytów pod mikroskopem stereologicznym. Uwolnić kompleksy oocyt-komórki cumulusa (COC), mocując jajnik do dna naczynia hodowlanego za pomocą igły o rozmiarze 27 G i używając drugiej igły do nakłu