Мейоза шпинделя оценка в мышь ооцитов по миРНК-обеспечиваемого молчания

Мейоз является уникальным процессом деления, что происходит в гамет (яйцеклеток и сперматозоидов) и включает в себя два последовательных деления, не вмешиваясь синтез ДНК, чтобы отделить гомологичные хромосомы и сестринские хроматиды во время мейоза-I и мейоз-II, соответственно ^1. Ошибки в сегрегации хромосом во время деления мейоза ооцитов может привести к анеуплоидии, которые наследуется эмбриона во время оплодотворения. Примечательно, что заболеваемость анеуплоидии в развивающихся эмбрионов увеличивается с продвижения материнского возраста и является основной причиной врожденных врожденных дефектов, а также потери беременности у женщин ^1,2, таким образом, подчеркивает важную необходимость, чтобы понять молекулярную основу анеуплоидии во деления мейоза ,

Во время деления клетки, расхождение хромосом в решающей степени зависит от комплектации аппарата микротрубочек веретена и установления стабильных хромосомных из микротрубочек взаимодействий для правильного крепления к противоположной шпинделяполюса. Важно отметить, что формирование мейоза шпинделя в ооцитах млекопитающих отличается от митоза в соматических клетках, и регулируется уникальных микротрубочек организации центров (MTOCs), которые не имеют центриолей ^3,4. Основные белки, необходимые для нуклеации микротрубочек и организации локализуются в ооцитов MTOCs, в том числе гамма-тубулина, который катализирует сборку микротрубочек. Кроме того, pericentrin функций, как одного из важнейших строительных лесов белка, который связывает и анкеров гамма-тубулина, а также других факторов на MTOCs ^5. Примечательно, наши исследования показывают, что истощение основных ЦОМТ связанных белков нарушает мейоза организации шпинделя и приводит к ошибкам хромосом в ооцитах, которые не в полной мере решены путем сборки веретена контрольно-пропускном пункте (SAC) ^6,7. Таким образом, дефекты в шпинделя стабильности, которые не вызывают задержку мейоза, представляют собой значительный риск в содействии анеуплоидии. Несмотря на их существенную роль в сборке и шпинделя организации, ооцитов MTOC протЭйн состав и функции еще недостаточно изучена.

Тестирование функции специфических белков-мишеней в ооцитах млекопитающих является сложной задачей, так как клетки становятся транскрипционно покоя незадолго до возобновления мейоза ^8,9. Следовательно, предовуляторного ооциты полагаться на материнской магазинах мРНК возобновить мейоз и поддерживать деления мейоза, а также первых делений дробления после оплодотворения ^10,11. Эффективность РНК-интерференции (RNAi), опосредованной деградации мРНК транскриптов в ооцитах млекопитающих хорошо известна и материнской РНК завербованные для перевода во время мейоза созревания особенно поддаются миРНК ориентации ^12-14. Таким образом, микроинъекции коротких интерферирующих РНК (миРНК) в ооциты предоставляет ценную подход к истощению целевых мРНК для функционального тестирования.

Здесь мы опишем методы для выделения ооцитов мыши и миРНК опосредованного истощения конкретных transcriPTS, чтобы проверить функцию важного ЦОМТ связанного белка, pericentrin. Кроме того, описаны условия анализа иммунофлуоресцентных оценить мейоза образование шпинделя в ооциты.