Mayoz gametlerin (oosit ve sperm) oluşur ve mayoz-I ve mayoz-II, sırasıyla 1 sırasında homolog kromozom ve kardeş kromatidler ayırmak için DNA sentezini müdahale olmadan iki ardışık bölümler içeren benzersiz bir bölünme sürecidir. Oositlerde öz değişmesine ait bölünme sırasında kromozomların dağılması hatalar fertilizasyon esnasında embriyo tarafından devralınır anoploidi, neden olabilir. Özellikle, gelişmekte olan embriyolarda anöploidi sıklığı anne yaşı ilerledikçe artar ve kadınlarda 1,2 gebelik kaybı yanı sıra konjenital doğum kusurları önemli bir nedenidir, bu nedenle, mayoz bölünme sırasında anöploidinin moleküler temelini anlamak için önemli bir ihtiyacı vurgulayan .
Hücre bölünmesi sırasında, kromozom ayrımı ters göbeğine doğru eki için mikrotübül mili aparatı ve istikrarlı kromozom-mikrotübül etkileşimlerin kurulması montajı ile ilgili hayati bağlıdırkutuplar. Önemli olarak, memeli oositlerinde öz değişmesine ait iğ formasyonu somatik hücrelerde mitoz farklıdır ve benzersiz mikrotübül organize merkezleri sentriyoller 3,4 eksikliği (MTOCs) tarafından düzenlenir. Mikrotübül çekirdeklenme ve organizasyon için gerekli esansiyel proteinler mikrotübül düzeneğini katalize γ-tubulin dahil oosit MTOCs, lokalize. Buna ek olarak, MTOCs 5 de bağlanan bir esas iskele proteini olarak işlev görür ve ankraj γ-tubulin gibi diğer faktörler pericentrin. Özellikle, çalışmalarımız önemli MTOC ilişkili proteinlerin tükenmesi mayoz iğ organizasyon bozar ve tam mili montaj kontrol noktasında (SAC) 6,7 tarafından çözüldü olmayan oosit kromozom ayrımı hataları neden olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, mayoz tutuklanmasını tetiklemez iğ istikrar kusurları, anöploidi katkıda önemli bir risk oluşturmaktadır. Mili montaj ve organizasyon, oosit MTOC prot önemli rolleri rağmenein kompozisyon ve fonksiyon pek iyi anlaşılamamıştır.
Hücreler kısa mayoz 8,9 yeniden başlaması öncesinde transkripsiyonel sakin olmak gibi memeli oositlerinde belirli hedef proteinlerin fonksiyonlarını test zordur. Bu nedenle, ön-ovulatuar oosit mayoz devam etmek için anne mRNA mağazaları güveniyor ve mayoz bölünme yanı sıra gübreleme 10,11 sonra ilk bölünme bölünmeleri destekler. Memeli oositlerinde mRNA transkriptlerinin RNA interferans (RNAi) aracılı degradasyon etkinliği iyi bilinmektedir ve mayoz olgunlaşma sırasında çeviri için işe anne RNA'lar siRNA 12-14 hedefleme için özellikle uygundurlar. Bu nedenle, oosit içine kısa müdahale RNA'lar mikroenjeksiyon (siRNA) fonksiyonel test için hedef mRNA'ları tüketmek için değerli bir yaklaşım sağlar.
Burada, fare oositleri ve spesifik Transcri siRNA aracılı tükenmesi izolasyonu için yöntemleri tarif ederPTS pericentrin temel bir MTOC ilişkili proteinin fonksiyonunu test etmek. Buna ek olarak, oositlerde öz değişmesine ait iğ formasyonunun değerlendirmek için immünofloresan analiz koşulları açıklar.
Bu prosedürün genel amacı, perrin gibi temel MTOC ilişkili proteinlerin irna aracılı depleksyonunu takiben sitlerdeki miyotik iğ oluşumunu ve organizasyonunu değerlendirmektir. Bu yöntem, kromozom ayrılmasını düzenleyen mekanizmalar ve tüm bölgelerde aneuploidiye yol açan potansiyel aksamalar gibi üreme biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bireysel sitlerin etkili transkript susturulması ve spesifik immünofloresan analizinin sağlanmasıdır.
Bu prosedür, neredeyse herhangi bir hedef proteini incelemek için de uyarlanabilir; toplama gününden 48 saat önce, oosit toplama için kullanılan dişi farelere intraperitonal olarak beş uluslararası ünite PMSG enjekte edin. Standart uygulamaları kullanarak yumurtalıkları topladıktan sonra, BSA ve mil reone ile desteklenmiş, önceden ısıtılmış ve dengelenmiş MEM besiyeri içeren bir kaba aktarın ve oositleri bir diseksiyon mikroskobu altında izole etmeye hazırlanın. Bir yumurtalığı, 27 gauge bir iğne kullanarak kültür kabının tabanına sabitleyin ve antral folikülleri oosit aspirasyonu veya standart ağızla pipetleme uygulamasıyla delmek için ikinci bir iğne kullanarak kumulus oosit kompleks