松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus (Steiner 和 Buhrer) Nickle）是最具破坏性的入侵物种之一，可导致松树萎蔫并最终死亡。这种致病性线虫原产于美国，但已被传播至包括中国、日本、韩国和葡萄牙在内的多个国家。最近，在西班牙也发现了该线虫，已导致数百万棵松树死亡，造成巨大的经济损失，并威胁到森林生产和生态系统的稳定性1-5。
一旦松树寄主被松材线虫感染，其树干内会迅速繁殖出数以十亿计的子代。这会导致木质部功能障碍，进而引起寄主树木萎蔫，最终导致其死亡6。然而，目前尚无有效控制该病害的方法。交配行为可能在该线虫高繁殖力中起重要作用7。因此，我们在实验室中研究了B. xylophilus的交配行为，试图寻找干扰其交配并降低其繁殖力的有效方法。
本方案旨在介绍获取松材线虫（B. xylophilus）未交配成虫以及利用录像机和体视显微镜观察与分析其交配行为的详细方法。该方案也可作为其他线虫行为学研究的参考。
本实验的总体目标是观察松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）的交配行为。该方法有助于推进对线虫的心理学研究，尤其针对松材线虫的交配行为进行观察。
该技术的主要优势在于能够获得未交配的成虫，从而更便于观察成虫的交配行为。该技术的应用意义主要延伸至线虫的广泛研究领域，因为各类线虫具有相似的生活周期和行为特征。本方法的演示至关重要，因为获取未交配的成虫较为困难，这需要对发育阶段的线虫进行精确操作和经验积累，且在早期一龄幼虫阶段很难准确区分雄性和雌性个体。
为了培养松材线虫，首先准备马铃薯葡萄糖琼脂平板。接种时，从褐褶菌菌膜上切取直径为10毫米的菌块，置于新的PDA平板中央。将菌膜在25摄氏度避光条件下培养5天。
五天后，将松材线虫加入已准备好的培养皿中，在黑暗条件下于25摄氏度培养三天。为从真菌中分离线虫，首先准备收集工具。在漏斗下方放置一段夹紧的橡胶管，并将准备好的漏斗固定在支架上，组装成贝尔曼漏斗装置。
然后，在漏斗口放置两层滤纸代替纱布。将真菌培养物转移至该漏斗装置中，并加水直至真菌菌膜完全浸没。两小时后，线虫将从真菌培养物中逸出，穿过滤纸，最终沉降至贝尔曼漏斗的最底部。
将15毫升离心管置于漏斗下方，缓慢松开夹子，收集数滴含有线虫的水样。在室温下以3,000 G离心力离心线虫样品2分钟。然后吸除上层水相，将线虫重新悬浮于1毫升水中。
将线虫悬液转移至一个六厘米的玻璃培养皿中，并加入三毫升水，以帮助线虫自由游动。现在，收集卵以制备 virgin 群体。将培养皿置于暗培养箱中，让怀卵雌虫产卵10分钟。
由于卵具有糖蛋白表面，它们会黏附在玻璃上。接下来，小心移除含有线虫的水，以避免扰动黏附在培养皿上的卵。然后，迅速向培养皿中重新加入3毫升水，以防止卵干燥。
重复此卵清洁过程至少三次，以去除所有幼虫和成虫，获得纯净的卵。向洗涤后的纯净卵收集物中加入 5 毫升水，并在 25°C 黑暗条件下继续培养卵。卵培养开始 24 小时后，收集孵化出的 J2 幼虫。
小心地将J2幼虫转移至一个15毫升离心管中。然后在3,000 G条件下离心收集物2分钟。吸除上层水相，并重新加入200微升水。
然后，将 J2 幼虫接种于含有真菌菌丝垫的 PDA 平板上进行培养。培养 52 小时后，大多数 J2 幼虫将发育为早期 J4 幼虫阶段。组装贝尔曼漏斗装置，并按照前述方法从真菌培养物中提取线虫，持续两小时。
等待期间，准备一根用于挑取线虫的针。将玻璃毛细管的尖端在酒精灯上加热，拉出一个尖头。该尖头直径需约为 50 微米，大致相当于一条成年线虫的体宽。
两小时后，将 J4 期幼虫转移至洁净的培养皿中，操作方法如前所述。现在，在体视显微镜下对线虫进行性别鉴定。通常约有三分之二的幼虫为雌性。
雌性的阴门在解剖结构上明显不同于雄性，但由于线虫活动性很强，区分性别需要经过练习。本实验方案最关键的步骤