マツノイセンチュウ、Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickleは、最も破壊的な侵入種の一つであり、パインの木のしおれと最終的な死を引き起こします。この病原性線虫は米国原産であると考えられていますが、中国、日本、韓国、ポルトガルなど、いくつかの国に輸送されました。最近では、スペインでも報告されており、莫大な経済的損失で何百万本もの松を枯らし、森林生産と生態系の安定を脅かしています1-5。

宿主の松の木がマツノザイセンチュウに感染すると、何千万もの子孫が幹内で急速に繁殖します。これは木部の機能不全を引き起こし、その結果、しおれ、最終的には宿主樹6が死に至る。しかし、現在のところ、この病気を効率的に制御する方法はありません。交配行動は、この線虫7の高い繁殖力に重要な役割を果たす可能性があります。そこで、B. xylophilusの交配行動を研究室で調べ、交配を乱し、繁殖力を低下させる効果的な方法を見つけようと試みました。

このプロトコルは、B. xylophilusの処女成虫の入手方法と、ビデオレコーダーと実体顕微鏡を使用して交尾行動を観察し分析する方法の詳細な方法を紹介することを目的としています。このプロトコルは、他の線虫の行動研究の参照としても使用できます。

この手順の全体的な目標は、マツノイセンチュウ、Bursaphelenchus xylophilusの交配行動を観察することです。この方法は、線虫の心理学的研究を進めるのに役立ちます。これは特に、マツノキセンチュウの交配行動の遵守を扱います。

この手法の主な利点は、処女の成体を得ることができるため、成体の交配行動を観察するのがはるかに容易になることです。この技術の意味は、線虫が同様のライフサイクル行動を持っているため、純粋に線虫の広範な研究にまで及びます。この方法のデモンストレーションは、発生性線虫の制約が練習を必要とし、初期の第一段階の幼体でオスとメスを正確に区別することが容易ではないため、処女成体線虫の獲得が困難であるため、非常に重要です。

マツノイセンチュウを培養するには、まずジャガイモのデキストロース寒天プレートを準備します。プレートに接種するには、ベトリタス・セナリア・マットから直径10ミリメートルの真菌マットを打ち抜き、新しいPDAプレートの中央に置きます。暗闇の中で25°Cで5日間菌マットを培養します。

5日後、準備したペトリ皿にマツノイセンチュウを加え、暗所で摂氏25度で3日間培養します。真菌から線虫を分離するには、まず収集ツールを準備します。漏斗の下にクランプされたゴムチューブを置き、準備した漏斗をラックに保持して、ベアマン漏斗装置を組み立てます。

次に、漏斗の口にガーゼの代わりに濾紙を2層置きます。次に、菌類の培養物を漏斗のセットアップに移し、菌類のマットが浸るまで水を加えます。2時間後、線虫は真菌培養物から出て、濾紙を横切り、ベアマン漏斗の最下部に落ち着きます。

漏斗の下に15ミリリットルのチューブを配置し、クランプをゆっくりと離して、線虫を含む数滴の水を集めて線虫を収集します。線虫コレクションを室温で2分間、3, 000 Gで遠心分離します。次に、水の上層部をアスパレートし、ワームを1ミリリットルの水に再懸濁します。

線虫の懸濁液を6センチメートルのガラス皿に移し、線虫が自由に泳ぐのを助けるために3ミリリットルの水を加えます。さあ、卵を集めてバージンストックを作りましょう。皿を暗いインキュベーターに移し、妊娠中の女性に10分間卵を産ませます。

それらの糖タンパク質表面のために、卵はガラスにくっつきます。次に、皿に付着した卵を邪魔しないように、ワームで水を慎重に取り除きます。次に、卵が乾くのを防ぐために、皿に3ミリリットルの水をすばやく戻します。

卵を掃除するこのプロセスを少なくとも3回繰り返して、すべての幼虫と成虫を取り除き、純粋な卵を手に入れます。洗浄した純粋な卵のコレクションに、5ミリリットルの水を加え、摂氏25度の暗闇で卵の発育を進めます。卵培養を開始してから24時間後、孵化したJ2幼虫を採取します。

J2幼虫を15ミリリットルのチューブに慎重に移