소나무 선충인 Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle은 가장 파괴적인 침입종 중 하나로, 소나무를 시들게 하고 결국 죽게 만듭니다. 이 병원성 선충은 미국이 원산지인 것으로 여겨지지만 중국, 일본, 한국, 포르투갈 등 여러 국가로 옮겨졌습니다. 최근에는 스페인에서도 보고되어 수백만 그루의 소나무를 죽이고 막대한 경제적 손실을 입었으며 산림 생산과 생태 안정성을 위협하고 있습니다1-5.
숙주 소나무가 소나무 선충에 감염되면 수억 마리의 자손이 줄기 내에서 빠르게 번식합니다. 이것은 물관부 기능 장애를 일으켜 시들게 하고 결국 숙주 나무6의 죽음을 초래한다. 그러나 현재로서는 이 질병을 통제할 수 있는 효율적인 방법이 없습니다. 짝짓기 행동은 이 선충7의 높은 번식력에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 따라서 우리는 실험실에서 B. xylophilus의 짝짓기 행동을 조사하여 짝짓기를 방해하고 번식력을 감소시키는 효과적인 방법을 찾기 위해 노력했습니다.
이 프로토콜은 B. xylophilus의 처녀 성체를 얻는 방법과 비디오 레코더와 실체 현미경을 사용하여 짝짓기 행동을 관찰하고 분석하는 방법에 대한 자세한 방법을 소개하기 위한 것입니다. 이 프로토콜은 다른 선충의 행동 연구를 위한 참고 자료로도 사용할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 소나무 선충인 Bursaphelenchus xylophilus의 짝짓기 행동을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 선충에 대한 심리학 연구를 진전시키는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 특히 소나무 선충의 짝짓기 행동 관찰을 다룹니다.
이 기술의 가장 큰 장점은 처녀 성체를 얻을 수 있어 성체 짝짓기 행동을 훨씬 쉽게 관찰할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 순전히 선충에 대한 광범위한 연구로 확장되는데, 이는 선충이 유사한 생활사 행동을 가지고 있기 때문입니다. 이 방법의 시연은 매우 중요한데, 발달 선충의 제약은 연습이 필요하고 초기 1단계 유년기에서 수컷과 암컷을 정확하게 구별하는 것이 쉽지 않기 때문에 처녀 성체 선충을 획득하는 것이 어렵기 때문입니다.
소나무 선충을 배양하려면 먼저 감자 포도당 한천 플레이트를 준비하십시오. 플레이트를 접종하려면 betritus senaria 매트에서 직경 10mm의 곰팡이 매트 조각을 펀칭하고 새 PDA 플레이트의 중간에 놓습니다. 어둠 속에서 섭씨 25도에서 5일 동안 곰팡이 매트를 배양합니다.
5일 후, 준비된 페트리 접시에 소나무 선충을 넣고 어둠 속에서 섭씨 25도에서 3일 동안 배양합니다. 곰팡이에서 선충을 분리하려면 먼저 수집 도구를 준비하십시오. 깔때기 아래에 클램프 고무 튜브를 놓고 준비된 깔때기를 랙에 고정하여 baermann 깔때기 장치를 조립합니다.
그런 다음 깔때기 입구에 거즈 대신 여과지를 두 겹 놓습니다. 이제 곰팡이 배양을 깔때기 설정으로 옮기고 곰팡이 매트가 잠길 때까지 물을 추가합니다. 2시간 후, 선충은 곰팡이 배양에서 나와 여과지를 건너 baermann 깔때기의 가장 낮은 부분에 정착합니다.
깔때기 아래에 15ml 튜브를 놓고 클램프를 천천히 풀어 선충을 포함할 물 몇 방울을 모아 선충을 수집합니다. 선충 컬렉션을 3, 000G에서 실온에서 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 물의 상층부를 비가시화하고 1 밀리리터의 물에 벌레를 다시 매달아 놓습니다.
선충의 현탁액을 6cm 유리 접시에 옮기고 3ml의 물을 넣어 선충이 자유롭게 수영할 수 있도록 합니다. 이제 알을 모아 처녀 주식을 만드십시오. 접시를 어두운 인큐베이터로 옮기고 임산부가 10분 동안 알을 낳게 합니다.
당단백질 표면 때문에 계란은 유리잔에 달라붙습니다. 다음으로, 접시에 붙어있는 계란을 방해하지 않도록 벌레가 있는 물을 조심스럽게 제거하십시오. 그런