Overview
Fonte: Laboratorio della Dott.ssa Lydia Finney — Argonne National Laboratory
La fluorescenza a raggi X è una radiazione indotta ed emessa che può essere utilizzata per generare informazioni spettroscopiche. La microscopia a fluorescenza a raggi X è una tecnica di imaging non distruttiva che utilizza l'emissione di fluorescenza indotta dei metalli per identificare e quantificare la loro distribuzione spaziale.
Principles
In primo luogo, devono essere preparati campioni sottili, piatti e asciutti (a meno che non sia disponibile uno speciale stadio criogenico per il microscopio). Successivamente, un fascio di raggi X monocromatico focalizzato viene scansionato raster attraverso il campione. Il fascio di raggi X supera l'energia di legame di alcuni degli elettroni del guscio interno agli atomi metallici, e quando gli elettroni del guscio esterno cadono in quei posti vacanti, una seconda radiografia viene emessa dal campione. In ogni punto di questa scansione raster, uno spettro di emissione di fluorescenza a raggi X viene raccolto dal rivelatore.
In questo spettro, viene registrata la lunghezza d'onda e l'intensità di tutti i raggi X emessi dal campione. In base all'energia caratteristica (dovuta alla spaziatura degli orbitali nell'atomo) della fluorescenza emessa e all'intensità relativa caratteristica dei picchi Kα e Kβ (ad esempio, che sono entrambi noti), lo spettro di emissione può essere utilizzato per determinare sia l'identità dei metalli presenti che la quantità.
Questo video spiegherà il processo di preparazione di un campione sottile e secco di cellule aderenti adatte per l'imaging a fluorescenza. Il processo di scansione dei campioni verrà spiegato brevemente e verrà descritta un'immagine di esempio.
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Procedure
1. Preparazione delle finestre in nitruro di silicio
- Usa una pinzetta inversa per raccogliere una finestra (le finestre in nitruro di silicio si frantumano se cadono).
- Posiziona la finestra su una diapositiva di vetro, lato piatto verso l'alto.
- Aderisci a piccoli pezzi di scotch ai lati della finestra e usali per far aderire le finestre sul fondo del piatto di cultura.
- Sterilizzare le finestre nei piatti di coltura con radiazioni UV. Ciò può essere ottenuto con l'impostazione di reticolazione automatica su un armadio di reticolazione UV, seguita da un'ulteriore irradiazione UV sotto la lampada UV nella cappa a flusso laminare per circa 1 ora.
2. Placcatura delle celle sulle finestre sterilizzate in nitruro di silicio
- Tenere il piatto con esso inclinato di circa 45 °.
- Aggiungere il supporto mediante pipettaggio verso il lato del piatto e alleviare lentamente l'angolo di inclinazione per rivestire la finestra con il supporto.
- Aggiungi le cellule al piatto di coltura, allo stesso modo, e incuba.
- Osservare le cellule di tanto in tanto usando un microscopio ottico per determinare quando sono pronte per l'uso.
3. Fissazione e asciugatura delle cellule
- In una cappa a flusso laminare, rimuovere il supporto mediante aspirazione delicata mentre si inclina il piatto come descritto sopra.
- Aggiungere PBS, pipettare verso il lato del piatto tenendolo ad angolo. Alleviare lentamente l'angolo di inclinazione per rivestire la finestra con PBS.
- Rimuovere il PBS con un'aspirazione delicata.
- Pipettando verso il lato del piatto e tenendolo ad angolo, aggiungere il 4% di PFA / PBS, pH 7 per coprire le cellule. Conservare in questa soluzione per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere la miscela PFA/PBS e smaltire come materiale pericoloso.
- Aggiungere PBS, pipettaggio come descritto sopra.
- Ripetere due volte i passaggi 3.5 e 3.6.
- Rimuovere il PBS mediante aspirazione delicata.
- Aggiungere 20 mM PIPES, 200 mM saccarosio, pH 7.
- Rimuovere i TUBI/saccarosio mediante delicata aspirazione.
- Ripetere due volte i passaggi 2.8 e 2.9.
- Tamponare rapidamente i bordi e la rientranza posteriore della finestra con un Kimwipe, quindi impostare la finestra su una superficie pulita, come un tappetino griglia di gomma, per asciugare.
4. Imaging a fluorescenza a raggi X delle cellule
- Una volta che il campione è asciutto, verificare la presenza di cellule sulle finestre utilizzando un microscopio ottico.
- Utilizzare lo smalto per fissare le finestre a un supporto in alluminio fornito dalla beamline.
- Inserire il supporto in alluminio in un supporto cinematico, quindi posizionarlo in posizione nel punto focale dell'ottica nel microscopio a raggi X e con un angolo di circa 45 ° rispetto al fascio di raggi X incidente, montato sugli stadi di nanoposizionamento del campione.
- Uscire dall'area dello strumento del microscopio a raggi X (di solito una gabbia fatta di pareti di piombo) e aprire l'otturatore. Eseguire i passaggi rimanenti da remoto.
- Utilizzando una piastra di zona o specchi Kirkpatrick-Baez, focalizzare il fascio di raggi X monocromatico (di solito 10 keV di energia) fino a una dimensione dello spot sub-micron.
- Utilizzando gli stadi del campione di nanoposizionamento e visualizzando la posizione del fascio di raggi X sul campione con una telecamera scintillatore a valle pre-calibrata, determinare la larghezza e l'altezza appropriate della scansione raster per acquisire i dati del campione.
- Con il rivelatore di deriva del silicio dispersivo a 90 ° dal fascio incidente e a circa 3 mm o meno dal campione, raccogliere uno spettro di prova con un tempo di permanenza di 1-2 secondi.
- Visualizzando lo spettro di prova, scegliere un tempo di permanenza appropriato per la scansione, per fornire un segnale-rumore sufficiente per gli elementi di interesse.
- Scegliere una risoluzione appropriata per la scansione, che non sia significativamente più piccola della dimensione dello spot del fascio sul campione, né più grande delle caratteristiche di interesse nel campione.
- Programmare la scansione nel software di scansione e raccogliere l'immagine.
La spettroscopia a fluorescenza a raggi X, o XRF, è una tecnica analitica non distruttiva che viene utilizzata per eseguire analisi elementari di campioni a temperatura ambiente.
XRF può essere applicato a una vasta gamma di campioni, tra cui biologici, forensi, ambientali e persino opere d'arte. I campioni possono anche assumere una varietà di forme, come polveri, cristalli e liquidi. In XRF, un campione viene bombardato con un fascio di raggi X che gli fa emettere raggi X secondari a un'energia inferiore, che sono chiamati radiazioni fluorescenti.
Sebbene sia indicata come una tecnica di fluorescenza, XRF differisce dalla microscopia a fluorescenza tradizionale in quanto non utilizza luce visibile a bassa energia o molecole attive alla luce.
Questo video introdurrà le basi dell'XRF e dimostrerà come raccogliere mappe elementari di un campione biologico.
Quando un fotone di energia sufficiente si scontra con un atomo, l'energia viene assorbita, eccitante uno degli elettroni del guscio esterno. Mentre l'elettrone si rilassa, emette un fotone secondario, tipicamente di energia inferiore. Questo processo è noto come fluorescenza. A differenza dei fotoni a bassa energia, come quelli utilizzati nella microscopia a fluorescenza, i fotoni a raggi X sono abbastanza energetici da espellere completamente gli elettroni strettamente trattenuti da un guscio interno. Un elettrone proveniente da un guscio ad alta energia cadrà quindi nel posto vacante. Viene rilasciato un fotone proporzionale alla differenza di energia tra i due gusci. Ogni elemento emette un insieme unico di fotoni, o spettro, che può essere utilizzato per identificare l'elemento e determinare la quantità presente. Questo fenomeno è noto come fluorescenza a raggi X.
Una volta che uno spettro elementare è stato raccolto, i segnali degli elementi di interesse possono essere isolati. Le misurazioni possono essere effettuate in più posizioni su un campione, generando un'immagine, un pixel alla volta. Questo processo è noto come scansione raster. Successivamente possono essere generate immagini di tutti gli elementi di interesse. Queste mappe elementari forniscono preziose informazioni sull'esempio. Con una comprensione di XRF, ora sei pronto per preparare un campione di cellule biologiche per generare mappe elementali.
Per iniziare, prima preparare e sterilizzare una finestra di nitruro di silicio, che manterrà il campione in posizione per la scansione. Usa attenzione, poiché sono molto fragili. Orientare la finestra in modo che sia piatta verso l'alto. Quindi posizionare la finestra in un piatto di cultura e aderire al piatto usando piccoli pezzi di nastro adesivo.
Infine, sterilizzare la finestra di nitruro di silicio con radiazioni UV per 1 ora.
Ora che la finestra è stata sterilizzata, il campione può essere fissato ad esso. Per prima cosa, tieni il piatto della cultura ad angolo e aggiungi il supporto al lato del piatto. Alleviare lentamente l'inclinazione per rivestire la finestra. Aggiungi le cellule al piatto nello stesso modo e incuba.
Osservare periodicamente le cellule al microscopio ottico fino a quando non sono pronte per l'uso.
In una cappa a flusso laminare, aspirare delicatamente il supporto dal piatto.
Quindi, risciacquare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato per rimuovere i mezzi in eccesso.
Aspirare il PBS e fissare le cellule con paraformaldeide. Dopo 20 minuti, rimuovere la miscela e smaltire come rifiuti pericolosi.
Rimuovi la finestra dal piatto e asciuga rapidamente i bordi e la rientranza posteriore della finestra con un Kimwipe. Impostare la finestra su una superficie pulita per asciugare.
Una volta che il campione è asciutto, verificare la presenza di cellule sulla finestra con un microscopio ottico.
Utilizzando lo smalto trasparente, fissare la finestra a un supporto in alluminio.
Inserire il porta campioni nel supporto dello strumento, quindi posizionare il supporto sullo stadio di posizionamento dei microscopi a raggi X.
Posizionare la finestra del campione nel punto focale dell'ottica del microscopio a raggi X, con un angolo di 45 gradi rispetto al fascio incidente.
Uscire dall'area dello strumento ed eseguire i passaggi rimanenti da remoto per ridurre al minimo l'esposizione ai raggi X.
Apri l'otturatore e usa l'ottica per mettere a fuoco il fascio di raggi X monocromatico fino a una dimensione dello spot sub-micrometrica.
La posizione dello spot può essere ripresa con una fotocamera pre-calibrata. Utilizzando le fasi di posizionamento, determinare la larghezza e l'altezza appropriate necessarie per raster sul campione.
Raccogli uno spettro di prova dell'elemento di interesse con un tempo di permanenza di 1 – 2 secondi.
Dallo spettro di prova, scegliere un tempo di scansione appropriato per fornire un rapporto segnale-rumore sufficiente per gli elementi di interesse.
Quindi, determinare la risoluzione necessaria per il campione. La risoluzione dovrebbe essere inferiore alle caratteristiche di interesse, ma più grande della dimensione dello spot. Infine, programmare la scansione nel software di scansione e raccogliere l'immagine.
In questo esperimento, è stata eseguita una mappa elementare di una cellula per diversi elementi. Molti metalli, come rame, ferro e zinco sono nutrienti importanti nella cellula e sono stati chiaramente identificati all'interno della cellula.
Determinando dove si trova ogni metallo nella cellula, è possibile chiarire informazioni preziose sui suoi normali processi cellulari. Inoltre, le malattie a base di metalli possono essere comprese.
La fluorescenza a raggi X è utilizzata in una vasta gamma di campi scientifici. La natura non distruttiva di XRF consente il suo utilizzo nello studio di manufatti storici. Gli storici dell'arte utilizzano la tecnica per determinare i pigmenti originariamente utilizzati nelle opere d'arte. Questo può chiarire le informazioni sull'opera, come la provenienza, i colori che sono sbiaditi nel tempo e l'autenticità. Gli scienziati forensi usano anche XRF nelle indagini sulla scena del crimine. Quando viene sparata una pistola, l'area circostante è rivestita con residui di colpi di pistola. Il residuo del colpo di pistola contiene polvere da sparo, primer di accensione e metallo dall'involucro e dal proiettile. Le informazioni raccolte con XRF possono identificare il colpevole e l'arma utilizzata.
Un altro campo di studio che si presta alla fluorescenza a raggi X è la paleontologia. Qui, le informazioni elementari sono raccolte da un fossile di trilobiti, un artropode marino vissuto oltre 250 milioni di anni fa.
Caratterizzando la composizione elementare dei fossili, è possibile ottenere nuove informazioni sulla lunga vita estinta. Campioni meglio conservati possono persino fornire la composizione di tessuti molli che si sono deteriorati molto tempo fa.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla fluorescenza a raggi X. Ora dovresti capire la teoria della spettroscopia a raggi X e come raccogliere informazioni elementari da una vasta gamma di fonti.
Grazie per l'attenzione!
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Results
La mappa di fluorescenza a raggi X di una cellula aderente è mostrata nella Figura 1. Ogni pannello mostra la distribuzione di un particolare elemento (ad esempio, rame, ferro, zinco, ecc.) sulla cella. Il pannello etichettato "s_a" mostra l'assorbimento dei raggi X.
Figura 1. Mappa di fluorescenza a raggi X di una cellula aderente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Applications and Summary
L'imaging a fluorescenza a raggi X può essere uno strumento utile in molti campi tra cui geoscienze, scienze forensi, scienza dei materiali, biologia e persino nello studio del nostro patrimonio culturale. Nella scienza dei materiali, può aiutare a trovare difetti in chip e catalizzatori realizzati con metalli. Nel lavoro sul patrimonio culturale, è stato utilizzato per identificare metalli velenosi nei capelli di famosi morti (ad esempio, Beethoven) e per identificare la fonte di vernici utilizzate nell'arte. In biologia, è usato per studiare i metalli naturali che eseguono importanti biochimiche. Nelle geoscienze, è spesso usato per studiare gli eventi raccontati nel record rock. Due caratteristiche particolari che rendono l'imaging a fluorescenza a raggi X utile in così tanti campi sono 1) il suo non distruttivo, così tanti oggetti rari o di alto valore possono essere ripresi, e 2) mentre la preparazione del campione qui descritta per le cellule è complessa - perché le cellule devono essere essiccate - per molti materiali come rocce, arte o altri oggetti, c'è pochissima preparazione del campione richiesta, a parte il fatto che dovrebbe essere piatto e privo di polvere. Sebbene sia necessario un sincrotrone a cui è meglio accedere attraverso la collaborazione con gli scienziati di queste strutture, la tecnica può essere molto accessibile.
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