Overview
Quelle: Labor von Dr. Lydia Finney — Argonne National Laboratory
Röntgen-Fluoreszenz ist eine induzierte, emittierte Strahlung, die verwendet werden kann, um spektroskopische Informationen zu generieren. Röntgen-Fluoreszenz-Mikroskopie ist eine zerstörungsfreie bildgebendes Verfahren, das die induzierte Fluoreszenzemission von Metallen zu identifizieren und quantifizieren, deren räumliche Verteilung verwendet.
Principles
Erstens müssen Proben vorbereitet werden, die sind dünn, flach und trocken (es sei denn, eine kryogene Wertungsprüfung für das Mikroskop zur Verfügung steht). Als nächstes ist ein fokussierter einfarbiger Röntgenstrahl Raster gescannt auf die Probe. Der Röntgenstrahl überwindet die Bindungsenergie von einigen der Innenschale, die Metall-Atome Elektronen, und wenn äußere Schale Elektronen in diese Stellen fallen, wird eine zweite Röntgenaufnahme von der Probe ausgegeben. An jedem Punkt in diesem Raster-Scan ist ein Röntgen-Fluoreszenz-Emissionsspektrum des Melders gesammelt.
In diesem Spektrum wird die Wellenlänge und die Intensität der Röntgenstrahlung, die durch die Probe emittiert aufgezeichnet. Anhand der charakteristischen Energie (durch den Abstand der orbitale im Atom) die emittierte Fluoreszenz und die charakteristischen relative Intensität der Kα undβ -Gipfel K (z. B., die beide bekannt sind), kann das Emissionsspektrum verwendet werden, die Identität der Metalle vorhanden und die Menge zu bestimmen.
Dieses Video erklärt den Prozess der Vorbereitung einer dünnen, trockene Probe von adhärenten Zellen geeignet für Fluoreszenz-Bildgebung. Der Prozess des Scannens Proben kurz erläutert werden, und ein Beispielbild beschrieben.
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Procedure
1. Vorbereitung der Silizium-Nitrid Windows
- Umgekehrte Pinzette ein Fenster (Siliziumnitrid, die Windows erschüttern werden herunterfallen) abholen.
- Legen Sie Fenster auf einen Objektträger, flachen Seite nach oben.
- Halten Sie kleine Stücke Klebeband an den Seiten des Fensters zu, und verwenden Sie diese, um die Fenster am unteren Rand der Kulturschale zu halten.
- Sterilisieren Sie die Fenster in Kultur Gerichte mit UV-Bestrahlung. Kann dies mit der Auto-Crosslink-Einstellung auf eine UV-Vernetzung-Schrank, gefolgt von weiteren UV-Bestrahlung unter der UV-Lampe in der Laminar-Flow-Haube für ca. 1 h.
(2) Beschichtung die Zellen auf die sterilisierten Silizium-Nitrid-Fenster
- Halten Sie das Gericht mit ihm in einem Winkel von 45° geneigt.
- Hinzufügen von Medien durch Pipettieren in Richtung der Seite der Schale und langsam entlasten den Neigungswinkel um das Fenster mit den Medien zu beschichten.
- Zellen in der Kulturschale auf die gleiche Weise hinzufügen, und inkubieren.
- Beobachten Sie die Zellen, die gelegentlich mit einem Lichtmikroskop um zu bestimmen, wann sie bereit sind zu verwenden.
(3) Fixierung und Trocknung von Zellen
- Entfernen Sie in einem Laminar-Flow-Haube das Medium durch sanftes Absaugen beim Kippen des Gerichts, wie oben beschrieben.
- Fügen Sie PBS, Pipettieren in Richtung der Seite der Schale schräg halten. Langsam zu entlasten den Neigungswinkel um die Fenster mit PBS zu beschichten.
- Entfernen Sie die PBS mit sanften Aspiration.
- Pipettieren in Richtung der Seite der Schale, und hielt sie in einem Winkel, fügen Sie 4 % PFA/PBS, pH 7, um die Zellen zu decken. Halten Sie in dieser Lösung für 20 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die PFA/PBS-Mischung, und als gefährliches Material entsorgen.
- Fügen Sie PBS, pipettieren, wie oben beschrieben.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 zweimal.
- Entfernen Sie die PBS durch sanftes absaugen.
- 20-mM-Rohre, 200 mM Saccharose, pH 7 hinzufügen.
- Entfernen Sie die Rohre/Saccharose durch sanftes absaugen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.8 und 2.9 zweimal.
- Schnell Beflecken der Kanten und Einzug des Fensters mit einem Wischtuch zurück, dann legen Sie das Fenster auf eine saubere Oberfläche, wie z. B. eine Gummimatte Raster, um zu trocknen.
4. Röntgen-Fluoreszenz-Bildgebung von Zellen
- Sobald die Probe trocken ist, überprüfen Sie das Vorhandensein von Zellen auf die Fenster mit einem Lichtmikroskop.
- Verwenden Sie Nagellack, um die Fenster zu einer Aluminium-Halterung durch das Strahlrohr zu sichern.
- Einfügen Sie den Aluminium-Halter in einer kinematischen Halterung und dann legen Sie es in Position im Brennpunkt der Optik in die Röntgenmikroskop und in einem Winkel von ca. 45° zur einfallenden Röntgenstrahl, montiert auf die Probe Nanopositionierung Bühnen.
- Beenden Sie Bereich Röntgenmikroskop Instrument (in der Regel ein Stall von Blei Wände gemacht), und öffnen Sie den Auslöser. Führen Sie die verbleibenden Schritte aus der Ferne.
- Mit eine Zonenplatte oder Kirkpatrick-Baez Spiegel, einfarbigen Röntgenstrahl konzentrieren (in der Regel 10 keV Energie) auf eine Sub-Mikrometer-spot-Größe.
- Nanopositionierung Probe Stufen verwenden und Anzeigen der Position der Röntgenstrahl auf die Probe mit einer vorkalibrierten nachgelagerten Szintillator-Kamera bestimmen, die entsprechende Breite und Höhe der Rasterscan um Daten der Probe zu erfassen.
- Mit der Wellenlänge-dispersive Silizium Drift Detektor bei 90° zum einfallenden Strahl und ca. 3 mm oder weniger aus der Probe sammeln ein Test-Spektrum mit einer Verweilzeit von 1 – 2 sec.
- Das Test-Spektrum anzeigen, wählen Sie eine angemessene Verweilzeit für den Scan, um genügend Signal-Rausch-für die Elemente von Interesse bieten.
- Wählen Sie eine geeignete Auflösung des Scans, die nicht deutlich kleiner als die Punktgröße des Strahls auf die Probe, noch größer als die Merkmale in der Stichprobe ist.
- Programmieren Sie den Scan in der Scan-Software zu, und sammeln Sie das Bild.
Röntgen-Fluoreszenz oder RFA, Spektroskopie ist eine nicht-destruktive analytische Technik, die verwendet wird, um elementare Analyse der Proben bei Raumtemperatur durchzuführen.
XRF kann auf eine Vielzahl von Proben, einschließlich biologischer, Forensik, Umwelt- und sogar Kunstwerke angewendet werden. Die Proben können auch eine Vielzahl von Formen, wie Pulver, Kristalle und Flüssigkeiten nehmen. In RFA wird eine Probe mit einem Strahl von Röntgenstrahlen verursacht es zu sekundären Röntgenstrahlen an einer niedrigeren Energie emittieren die Fluoreszenzstrahlung genannt werden bombardiert.
Obwohl es als ein Fluoreszenz-Technik bezeichnet wird, unterscheidet sich RFA aus traditionellen Fluoreszenzmikroskopie keine niedrigeren Energie sichtbares Licht oder Licht-aktive Moleküle verwendet werden.
Dieses Video wird Grundkenntnisse über RFA und zeigen, wie elementare Karten von einer biologischen Probe zu sammeln.
Wenn ein Photon ausreichender Energie mit einem Atom kollidiert, wird die Energie absorbiert, spannende eines der äußeren Schale Elektronen. Sobald das Elektron sich entspannt, strahlt es ein sekundäres Photon in der Regel der niedrigeren Energie. Dieser Prozess wird als Fluoreszenz bezeichnet. Im Gegensatz zu energieärmeren Photonen, wie Sie auch in der Fluoreszenzmikroskopie sind Röntgen-Photonen energisch genug fest gehaltene Elektronen aus einer Innenschale komplett zu vertreiben. Ein Elektron von einer höheren Energie-Schale fällt dann in die freie Stelle. Ein Photon proportional zur Energiedifferenz zwischen die beiden Schalen wird freigegeben. Jedes Element strahlt eine einzigartige Reihe von Photonen oder Spektrum, das verwendet werden kann, um das Element zu identifizieren und bestimmen die Menge vorhanden. Dieses Phänomen wird als Röntgenfluoreszenz bezeichnet.
Sobald ein elementares Spektrum erfasst wurden, können die Signale der Elemente isoliert werden. Messungen können an mehreren Standorten über eine Probe, erzeugen ein Bild, ein Pixel zu einem Zeitpunkt durchgeführt werden. Dieser Prozess wird als Raster Scannen bezeichnet. Bilder aller Elemente von Interesse können anschließend generiert werden. Diese elementaren Karten liefern wertvolle Informationen über die Probe. Mit einem Verständnis der RFA sind Sie nun bereit, eine biologische Zellprobe elementare Karten generieren vorzubereiten.
Um zu beginnen, zunächst bereiten Sie vor und sterilisieren Sie eine Silizium-Nitrid Fenster, in dem die Probe für den Scan halten wird. Vorsicht, da sie sehr empfindlich sind. Ausrichten des Fensters, sodass es flache Seite nach oben zeigt. Legen Sie das Fenster in der Kulturschale, und halten Sie es in die Schale mit kleinen Stücken von Klebeband.
Zu guter Letzt Sterilisieren der Silizium-Nitrid Fenster mit UV-Bestrahlung für 1 Stunde.
Nun, da das Fenster sterilisiert worden, kann die Probe darauf fixiert werden. Erstens der Kulturschale schräg halten und Hinzufügen von Medien zur Seite des Tellers. Entlasten Sie langsam die Neigung um die Fenster zu beschichten. Das Gericht in der gleichen Weise Zellen hinzu, und inkubieren.
In regelmäßigen Abständen beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop, bis sie einsatzbereit sind.
Aspirieren Sie in einem Laminar-Flow-Haube sanft die Medien aus der Schale.
Spülen Sie die Zellen mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, überschüssige Medium zu entfernen.
Aspirieren der PBS, und befestigen Sie die Zellen mit Paraformaldehyd. Entfernen Sie nach 20 min die Mischung und als Sondermüll entsorgen.
Die Fenster aus der Schale entfernen und schnell Beflecken der Kanten und Einzug des Fensters mit einem Wischtuch zurück. Legen Sie das Fenster auf einer sauberen Fläche trocknen lassen.
Sobald die Probe trocken ist, überprüfen Sie das Vorhandensein von Zellen auf das Fenster mit einem Lichtmikroskop.
Mit klaren Nagellack, sichern Sie das Fenster an einen Aluminium-Inhaber.
Einsetzen Sie der Probenhalter in die Instrument-Halterung, dann platzieren Sie die Halterung auf die Röntgen-Mikroskope Positionierung Bühne.
Positionieren Sie das Fenster "Beispiel" im Brennpunkt der Röntgenmikroskop Optik, mit einem 45-Grad-Winkel zum einfallenden Strahl.
Beenden Sie die Instrument-Bereich und führen Sie die verbleibenden Schritte aus der Ferne um die Strahlenbelastung zu minimieren.
Öffnen Sie den Verschluss zu, und verwenden Sie Optik einfarbigen Röntgenstrahl auf eine Sub-Mikrometer-Punktgröße zu konzentrieren.
Die Position der Stelle kann mit einer vorkalibrierten Kamera abgebildet werden. Mit der Positionierung Phasen bestimmen Sie die entsprechende Breite und Höhe musste Raster über die Probe.
Sammeln Sie ein Test-Spektrum des Elements von Interesse mit einer Verweilzeit von 1 – 2 Sekunden.
Wählen Sie aus dem Test-Spektrum eine entsprechende Scan-Zeit um eine ausreichende Signal-Rausch-Verhältnis für die Elemente zu schaffen.
Anschließend bestimmen Sie die Auflösung für die Probe benötigt. Die Auflösung sollte kleiner als die Features von Interesse, aber größer als die Punktgröße. Schließlich programmieren Sie den Scan in der Scan-Software zu, und sammeln Sie das Bild.
In diesem Experiment wurde eine elementare Karte einer Zelle für mehrere verschiedene Elemente aufgeführt. Viele Metalle, wie Kupfer, Eisen und Zink sind wichtige Nährstoffe in die Zelle und wurden innerhalb der Zelle eindeutig identifiziert.
Indem Sie bestimmen, wo jedes Metall in der Zelle gefunden wird, kann wertvolle Informationen über die normalen zellulären Prozesse geklärt werden. Darüber hinaus können Metall-basierte Krankheiten verstanden werden.
Röntgen-Fluoreszenz wird in den unterschiedlichsten wissenschaftlichen Bereichen verwendet. Die nicht-destruktive Charakter des RFA ermöglicht seine Verwendung in der Studie von historischen Artefakten. Kunsthistoriker nutzen die Technik um die Farbpigmente, die ursprünglich in Kunstwerke zu bestimmen. Dies kann Informationen über die Arbeit, wie die Herkunft, Farben erhellen, die über die Zeit und die Echtheit verblasst sind. Forensische Wissenschaftler verwenden auch RFA in den Tätern. Wenn eine Waffe abgefeuert wird, ist die Umgebung mit Schuss Rückstand beschichtet. Gun Shot Rückstände enthält Schießpulver, Zündung Primer und Metall aus dem Gehäuse und Kugel. Mit RFA gesammelte Informationen kann die Täter und die Tatwaffe identifizieren.
Ein weiteres ist Forschungsgebiet, das sich, um Röntgen-Fluoreszenz eignet Paläontologie. Hier ist elementare Informationen aus ein Trilobit Fossil, ein marine Gliederfüßer gesammelt, die vor 250 Millionen Jahren gelebt.
Durch die Charakterisierung der Elementzusammensetzung von Fossilien, können neue Informationen über längst ausgestorbenen Leben gewonnen werden. Zeichnerisch Proben bieten auch die Zusammensetzung der Weichteile, die vor langer Zeit verschlechtert haben.
Sie habe nur Jupiters Einführung in Röntgenfluoreszenz beobachtet. Sie sollten jetzt verstehen die Theorie der Röntgenspektroskopie und elementare Informationen aus unterschiedlichsten Quellen zu sammeln.
Danke fürs Zuschauen!
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Results
Die Röntgen-Fluoreszenz-Karte von eine adhärente Zellen ist in Abbildung 1dargestellt. Jedes Panel zeigt die Verteilung eines bestimmten Elements (z. B. Kupfer, Eisen, Zink usw.) über die Zelle. Das Gremium beschriftet "S_a" zeigt die Absorption von Röntgenstrahlen.
Abbildung 1: Röntgen-Fluoreszenz-Karte von eine adhärente Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Applications and Summary
Röntgen-Fluoreszenz-Bildgebung kann ein nützliches Instrument in vielen Bereichen einschließlich der Geowissenschaften, Kriminaltechnik, Materialwissenschaften, Biologie und auch im Studium unseres kulturellen Erbes. In der Materialwissenschaft kann es helfen, Fehler in Chips und Katalysatoren, die mit Metallen zu finden. In Kulturerbe arbeiten hat es um giftige Metalle in den Haaren der berühmten Toten (z. B. Beethoven) zu identifizieren und zur Identifizierung der Quelle von Lacken verwendet in der Kunst eingesetzt. In der Biologie dient es der natürliche Metalle zu studieren, die wichtige Biochemie durchführen. In Geowissenschaften ist es oft verwendet, um Ereignisse aufgezeichnet in der Rock-Datensatz zu studieren. Zwei Besonderheiten, die Röntgen-Fluoreszenz-Bildgebung nützlich, so viele Felder 1 sind) seine nicht-destruktiv, so dass viele Elemente, die sind selten, oder von hohem Wert abgebildet werden können, und (2) während der Probenvorbereitung beschrieben hier für Zellen ist komplex, da die Zellen getrocknet für viele Materialien wie Steinen, Kunst oder andere Gegenstände sein müssen, gibt es sehr wenig Probenvorbereitung , außer es sollte flach und frei von Staub sein. Obwohl ein Synchrotron erforderlich ist am besten durch die Zusammenarbeit mit Wissenschaftlern in diesen Einrichtungen zugegriffen, die Technik kann sehr gut zugänglich sein.
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