Overview
출처: 유리 볼산 박사 연구소 — 온타리오 공과대학
얇은 층 크로마토그래피(TLC)는 비휘발성 화합물의 혼합물을 분리하는 데 사용되는 크로마토그래피 방법입니다. TLC 플레이트는 플라스틱, 알루미늄 또는 유리1과같은 적절한 고체 지지에 고정된 흡착재(고정상)의 얇은 층으로 구성된다. 샘플(들) 및 기준 화합물(들)은 적절한 용매에 용해되고 작은 반점에 TLC 플레이트의 바닥 가장자리 근처에 적용됩니다. TLC 플레이트는 적절한 이동 상으로 구성된 개발 용매에 바닥 가장자리를 침지하여 개발됩니다. 모세관 작용을 통해 모바일 위상이 흡착 층을 위로 이동할 수 있습니다. 용매가 TLC 플레이트위로 이동함에 따라 각 지점의 구성 요소를 운반하고 이동 및 고정 단계와의 물리적 상호 작용에 따라 분리됩니다.
Principles
크로마토그래피는 2상2사이에 성분을 분배하여 화합물의 혼합물을 분리하는 것을 포함한다. 고정된 위상은 고정된 위상이 고정된 단계를 통해 흐를 수 있는 반면, 혼합물의 성분을 운반한다. 이동상에서용해도와 같은 화합물의 특성과 고정상과의 상호작용의 강도는 매체를 통해 전달되는 속도에 영향을 미친다. 화합물의 다른 유형은 다른 물리적 특성을 가지고 있기 때문에, 그들은 혼합물의 구성 요소의 분리를 허용 하는 다른 속도로 수행.
이 비디오는 1차원 얇은 층 크로마토그래피(TLC)의 기술을 사용하여 화합물 혼합물의 분리 및 시각화를 시연합니다.
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Procedure
1. TLC 플레이트
- TLC를 위한 일반적인 흡착제는 실리카 젤, 알루미나 및 셀룰로오스입니다. TLC 플레이트는 다양한 특성으로 시판됩니다. TLC 플레이트를 선택하고 적절한 크기로 잘라냅니다 (대부분의 응용 분야에 는 약 5cm x 5cm가 충분합니다). 유리로 뒷받침되는 TLC 플레이트의 경우 눈금자와 유리 커터를 사용하여 유리를 득점한 다음 라인을 따라 조심스럽게 끊습니다.
2. 스포팅
- 시료를 적합한 용매에 녹여 약 1% 용액을 만듭니다. 가능하면 용매는 극적이지 않아야 합니다. 컬럼 크로마토그래피 분획 및 기타 희석용액은 0.2%와 2.0%의 농도로 존재할 경우 희석 없이 사용될 수 있다.
- 접시 바닥에서 약 1.0cm 의 연필로 기준선을 표시합니다. 플레이트 가장자리에서 최소 1.0cm 떨어진 지점에서 반점을 배치하고 적절하게 라벨을 붙입니다.
- 반점은 유리 모세관을 사용하여 적용될 수 있다. TLC 플레이트를 발견하려면 모세관을 용액에 담그고 소량의 액체를 그립니다. TLC 플레이트의 원하는 위치에 팁을 부드럽게 터치하고 즉시 제거합니다.
- 또는 각 응용 프로그램에 대해 약 1 μL의 솔루션을 제공함으로써 마이크로리터 주사기로 반점을 적용하십시오.
- 반점은 스포터와 흡착의 표면을 방해하지 않도록주의, 각 위치에 연속적으로 적용 될 수있다. 용매가 응용 프로그램 사이에 건조되도록 합니다.
3. 개발 용매 선택
- 양호한 분리를 위해 가능한 극성 용매를 사용하는 것이 바람직하다. TLC를 위한 일반적인 용매는 헥산, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄 및 메탄올(표1)을포함한다.
- 적절한 모바일 단계를 찾을 수 있는 편리한 방법은 샘플로 TLC 플레이트를 발견하는 것입니다. 직경 1-2cm의 용매 원을 형성하기 위해 충분한 용매를 그 자리에 직접 적용합니다. 원 둘레를 표시합니다. 시각화 시 적절한 용매는 잘 분리 된 링을 표시하며, 중앙에서 용매 전면까지의 거리의 약 50 %가 바깥쪽 링이 표시됩니다.
- 두 개의 잘못된 용매를 선택하고 다양한 비율로 테스트하여 모바일 단계의 극성을 조정해야 할 수도 있습니다. 일반적인 혼합물의 예는 메탄올을 가진 에틸 아세테이트와 디클로로메탄을 가진 헥산입니다.
4. 개발
- 점박이 TLC 플레이트를 개발 챔버에 배치하여 적절한 개발 용매를 함유하고 있습니다. 용매 라인은 TLC 플레이트에 표시된 기준선 아래에 있어야 합니다.
- 개발 챔버는 뚜껑이있는 항아리 또는 알루미늄 호일 또는 플라스틱 필름으로 덮인 비커일 수 있습니다. TLC 플레이트를 수용할 수 있는 가장 작은 용기를 사용합니다.
- 용매가 플레이트의 상단 가장자리에 도달하는 것을 허용하지 마십시오. 용매 전면(흡착구의 젖은 부분이 끝나는 경계)이 플레이트 상단에서 5-10mm인 경우, 개발 챔버에서 TLC 플레이트를 제거하고 용매가 건조하기 전에 연필로 용매 전면을 표시한다.
5. 시각화
- 색점반은 즉시 시각화되고 연필로 표시될 수 있습니다. 종종 반점이 표시되지 않으므로 다른 방법으로 시각화해야 합니다.
- 종종 TLC 흡착에는 형광 표시등이 포함되어 있습니다. 반점은 휴대용 자외선(UV) 램프를 사용하여 시각화될 수 있다. 형광을 담금질하는 화합물은 플레이트가 단파 (254 nm) UV 빛으로 조사 될 때 어두운 반점으로 나타납니다. 형광 화합물은 적절한 파장의 UV 빛으로 조사 할 때 밝은 반점을 생성합니다. 연필로 각 지점의 중앙을 표시합니다.
- 또한 TLC 플레이트에 시각화 시약 또는 얼룩을 적용하여 반점이 시각화될 수 있습니다. 상기 시각화 시약은 플레이트를 시약에 담그거나, 부식성이 없는 시약으로 포화된 면공으로 플레이트를 닦음으로써 적용될 수 있다.
- 에탄올내 인산의 20% 용액은 대부분의 유기 화합물의 시각화에 유용하다. 반점은 열총이나 오븐으로 접시를 가열할 때 나타납니다.
- 다른 시약은 화합물의 특정 클래스의 시각화에 사용될 수있다. 예를 들어, 닌히드린 시약은 아미노산 시각화에 사용되며, 알데히드와 케톤에 대한 2,4-디니트트로페닐히드라진이 사용된다.
6. 분석
- 지체 계수(Rf)는화합물이 용매가 이동하는 거리로 TLC 플레이트를 이동하는 거리의 비율입니다. 이는 기준선에서 스팟의 중심으로의 거리를 측정하고 값을 베이스라인에서 용매 전면까지의 거리로 나누어 서 결정될 수 있다.
- 화합물의 Rf는 그 물성의 특성과 흡착, 온도 및 샘플 크기의 온도, 샘플 크기 및 활동과 같은 요인에 의존한다.
- 알 수 없는 알 수 있는 화합물과 동일한지 확인 하려면 동일한 TLC 플레이트에서 표준을 찾아야 합니다. 동일한 물질은 동일한 특성 Rf를가질 것입니다.
얇은 층 크로마토그래피, 또는 TLC는, 일반적으로 유기 화학에 사용되는 비 휘발성 화합물의 혼합물을 분리하는 데 사용되는 크로마토그래피 방법입니다.
TLC는 유리 또는 플라스틱 지원 플레이트에서 수행됩니다. 표판에 레이블과 함께 기준선이 표시됩니다. 검사되는 혼합물 및 기준 화합물은 적절한 용매에 용해되고 작은 반점에 TLC 플레이트의 바닥 가장자리 근처에 적용됩니다. 플레이트는 항아리에 배치되고, 용매(mobile phase)는 각 성분의 물리적 특성에 기초하여 혼합물을 분리한다.
더 많은 계측기 무거운 분리 기술이 TLC보다 더 많은 해결 전력을 가지고 있다는 사실에도 불구하고, TLC를 즉석 질적 분석을위한 매력적인 기술으로 만드는 속도와 저렴한 비용입니다. 이 비디오는 얇은 층 크로마토그래피의 준비, 작동 및 분석을 보여줍니다.
크로마토그래피 기법은 고정 및 이동 단계를 포함한다. TLC에서 고정 된 위상은 플레이트에 고정 된 재료의 얇은 층으로 구성됩니다. 재료는 실리카 젤과 같은 극성 물질입니다. 이동 상은 모세관 작용에 의해 흡착 층을 이동하는 비 극성 액체입니다. 이동 상이 플레이트위로 이동함에 따라 각 지점의 구성 요소를 따라 드래그되며, 이는 극성에 따라 분리됩니다.
덜 극성 화합물은 접시위로 당겨질 때 이동 단계에서 더 많은 시간을 보낼 것입니다. 더 극성 화합물은 고정 된 단계에 더 끌리므로 지금까지 플레이트를 위로 이동하지 않습니다.
분리는 개발 컨테이너에서 이루어집니다. 뚜껑이 있는 항아리나 알루미늄 호일로 덮인 비커일 수 있습니다. 분리 속도를 높이기 위해 TLC 플레이트를 수용할 수 있는 가장 작은 용기를 사용합니다.
이동 상 또는 용매를 개발하는 것은 양호한 분리를 위해 가능한 한 비극성이어야 합니다. 여기에 실리카 젤에 대한 eluotropic 시리즈, 추출 전력을 증가순서로 일반적인 모바일 단계의 목록입니다.
여러 이동 단계를 동시에 테스트할 수 있습니다. 깨끗한 접시에 용해 된 샘플을 여러 번, 적어도 2cm 떨어져 놓습니다. 각 지점에 충분한 이동 단계를 적용하여 직경 1-2cm의 원을 형성합니다.
이동 상이 이동하는 거리를 표시합니다. 이동 상이 충분히 극적이지 않으면 샘플은 초기 지점에 가깝게 유지됩니다. 이동상이 너무 극성인 경우 모든 샘플이 용매 전면으로 마이그레이션됩니다. 적절한 이동 단계는 잘 분리 된 링을 표시합니다, 용매 전면에 거리의 약 50 %의 외부 링.
필요한 경우, 두 가지 잘못된 모바일 단계는 원하는 특성을 얻기 위해 다양한 비율로 혼합 될 수있다. 여기서, 에틸 아세테이트와 헥산의 1:1 혼합물은 너무 극성이었다, 그러나 1:20 혼합물은 적절하게 분리되었다.
모바일 단계를 선택하면 플레이트 개발을 시작할 준비가 되었습니다.
절차를 시작하려면 시판되는 TLC 플레이트를 원하는 크기로 잘라냅니다. 접시에 유리 받이가 있는 경우 유리 커터로 점수를 매기고 라인을 따라 조심스럽게 파손합니다.
연필로 접시 바닥에서 약 1cm 의 기준선을 표시합니다. 샘플을 선 따라 발견할 위치를 표시합니다. 반점이 가장자리에서 적어도 1cm, 3mm 떨어져 있는지 확인하십시오. 적절하게 라벨을 지정합니다.
고체 시료는 적합한 용매에 용해되어야 합니다. 일반적인 용매는 헥산, 에틸 아세테이트 또는 디클로로메탄을 포함한다. 샘플을 용해시킬 최소 극성 용매를 사용합니다.
유리 모세관으로 시료/용매 혼합물을 그립니다. TLC 플레이트의 원하는 위치에 팁을 부드럽게 터치하고 즉시 제거합니다. 고정 된 단계를 방해하지 않는 것이 중요합니다.
이 더 나은 분리로 이어질, 가능한 한 작은 자리를 유지합니다. 더 많은 샘플이 필요한 경우 각 위치에서 반점이 연속적으로 적용될 수 있습니다. 용매가 응용 프로그램 간에 건조하도록 합니다. 공기 의 흐름은 덜 휘발성 용매를 건조하는 데 사용할 수 있습니다.
이제 TLC 플레이트를 개발할 준비가 되었습니다. 항아리 바닥에 필터 용지 를 놓아 증기 압력을 증가시면 됩니다. 기준선에 도달하지 않는 깊이에 모바일 위상을 추가합니다. 용매 증기가 탈출하지 않도록 사용하지 않을 때 항아리를 캡.
발견 된 TLC 플레이트를 개발 항아리에 조심스럽게 놓습니다. 모바일 단계가 기준선 아래에 있는지 확인합니다. 용매 전면의 진행 상황을 지켜보십시오 - 이동 단계의 선두 가장자리 - 플레이트위로 빠르게 이동합니다.
샘플 밴드가 확산을 통해 확장되기 시작하기 때문에 이동 상이 플레이트의 상단 가장자리에 도달하는 것을 허용하지 마십시오. 용매 전면이 상단에 가까워지면 개발 챔버에서 플레이트를 제거하고 용매가 건조하기 전에 연필로 용매 전면을 표시합니다.
화합물이 채색되지 않은 경우 UV 램프를 사용하여 반점을 시각화할 수 있습니다. 화합물은 플레이트의 배경 형광을 차단합니다. 램프를 단파 설정으로 설정하고 건식 플레이트를 비춥습니다. 연필을 사용하여 램프 아래에 보이는 모든 반점을 간략하게 설명합니다. 연필을 사용하여 램프 아래에 보이는 모든 반점을 간략하게 설명합니다.
또 다른 가능한 시각화 기술은 산화 제인 과만가네이트 칼륨을 사용하는 것입니다. 핀셋을 사용하여 접시를 퍼망가네이트 얼룩에 담급넣습니다.
종이 타월로 여분의 용액을 제거하고 두드려. 연기 후드에서 접시를 열면 열을 가하여 반점을 시각화합니다. 연필을 사용하여 나타나는 모든 반점을 표시합니다.
반점이 시각화되면 관심의 실체는 여기에 표시된 것과 같이 표준과 비교할 수 있습니다. 이 예에서, 알 수 없는 것은 유기 합성의 빌딩 블록인 1,3-디페닐프로필미노네이다. 대역을 공지된 표준 및 벤조일 염화물, 시작 재료 중 하나에 비교함으로써, 제품을 식별할 수 있다.
지체 계수 또는 Rf는알 수 없는 화합물을 식별하는 데 사용됩니다. Rf는 화합물이 이동 하는 거리의 비율으로 이동 하는 거리. 계수는 기준선에서 스팟까지의 거리를 측정하고 기준선에서 용매 전면까지의 거리로 나누어 결정됩니다.
주어진 화합물의 Rf는 흡착, 온도 및 샘플 크기의 용매 선택, 두께 및 활성을 포함하여 실험에 사용되는 조건에 의존한다. 실험 사이에 일관된 이러한 요소를 유지하기 위해주의를 기울여야합니다.
얇은 층 크로마토그래피의 여러 응용 프로그램이 있습니다.
이 예에서는, 박쥐 피지선의 트리아실글리세라이드 함량을 연구되었다. 지질 표면 분획은 먼저 TLC 플레이트의 극성에 의해 분리되었다. 트리아실글리세라이드 밴드는 주걱으로 접시에서 제거되었습니다. 실리카 분말은 용매가 있는 미세원심분리기 튜브로 이송되었다. 원심분리 후, 고정된 위상은 튜브의 바닥에 남아 있었고, 화합물은 용매에 용해되어 있었다. 트리아실글리세라이드는 다른 물리적 특성에 의해 더 분리되었다. 이 경우, 분리의 두 번째 차원은 분자 크기였다.
TLC는 또한 화학 반응의 진행을 감시하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 예에서, 반응의 시작 재료는 표준으로 사용되었고, TLC 플레이트의 반응 용액과 함께 달렸다. 이 과정은 반응 의 과정을 통해 특정 간격으로 반복되었다. 반응이 진행됨에 따라 시작 재료 밴드가 감소하고 제품 밴드가 확대되었습니다. 밴드에 변화가 없거나 모든 시작 재료가 소모되었을 때 반응이 완료되었습니다.
마지막으로, TLC 플레이트는 생체 분해에 사용될 수 있습니다. 이 예에서 화합물은 TLC로 적색 클로버로부터 분리되었다. 각 밴드는 다음 천 접시에 성장 하는 박테리아에 배치 되었다. 억제 된 세균 성 성장을 보여 준 분자는 그들의 항균 특성에 대 한 추가 분석 되었다.
당신은 막 얇은 층 크로마토그래피에 JoVE의 소개를 보았다. 이제 분리의 기본 이론, 실험에 적합한 모바일 단계를 선택하는 방법, TLC 플레이트를 설정하고 운영하는 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
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Results
일반적인 TLC 플레이트의 예는 도 1에도시된다. 알 수 없는 화합물 'A'는 'E'를 통해 공지된 표준 'B'와 비교될 수 있다. 각 성분에 대한 Rf 값의 측정은 각각의 화합물을 발견하고, TLC 플레이트를 개발하고, 시각화함으로써 달성된다. 알 수 없는 화합물 'A'의 Rf는 현물 높이(y)를 측정하고 용매 높이(z)로 나누어 계산한다. 이 값을 각 표준에 대해 결정된 Rf와 비교하면 알 수 없는 화합물을 식별할 수 있습니다.
그림 1. TLC 플레이트의 회로도. 지체 계수(Rf)는조건이 일정하게 유지되는 한 실험 간에 일관성이 있어야 합니다.
표 1. 실리카 젤용 에루오트로픽 시리즈. 용출력 증가 순으로 일반적인 모바일 단계 목록입니다.
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Applications and Summary
TLC는 실험실에서 다양한 실용적인 응용 프로그램을 보유하고 있습니다. TLC는 표준과 비교하여 알 수 없는 화합물및 알 수 없는 혼합물 성분을 식별하는 데 사용될 수 있다. TLC는 일반적으로 화학 반응의 과정을 모니터링 하는 데 사용 됩니다., 그리고 반응의 상대적인 양의 비교를 통해 제품의 순도를 평가, 제품, 그리고 시간이 지남에 따라 연속 된 크로마토 그램에 부산물. TLC는 또한 다른 방법(예: 재결정 또는 증류)에 의해 정제된 물질이 여전히 상당한 양의 불순물을 포함하고 있는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다.
유사한 화합물이 TLC로 해결할 수 없는 경우, 2차원 분리라고 하는 다른 물리적 특성에 따라 더 분리될 수 있다. 한 예에서, TLC는 포유류 피지선에 의해 분비된 광범위한 지질 클래스 (트리글리세라이드, 스테롤, 지방산 등)를 분리하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 다른 클래스는 질량 분석법 3에의해 더 분리되었다.
미생물학에서, TLC는 새로운 식물 계 항균 화합물4에대한 생물 학공학 선별에 사용된다. 일단 화합물이 문제의 식물의 추출물에서 분리되면, 밴드는 미생물 배양에 직접 적용 될 수있다. 성장을 억제 하는 관찰 되는 밴드 다음 더 가능성이 후보로 공부.
TLC는 열 크로마토그래피에 의한 혼합물의 분리를 위한 적절한 이동 상을 결정하는 간단한 방법입니다. 또한, 컬럼 크로마토그래피 분리 중에 수집된 다양한 분획의 조성물을 결정하는 데 사용되며, 원하는 화합물을 함유하는 분획을 식별하고 수집할 수 있도록 한다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
References
- Lehman, J. W. The student's lab companion: laboratory techniques for organic chemistry: standard scale and microscale. Pearson College Div, (2008).
- Pavia, D. L., Lampman, G. M., Kriz, G. S., & Engel, R. G. Microscale and Macroscale Techniques. Thomson Wadsworth, (2006).
- Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, (2013).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (85), e51411, (2014).
