Overview
Fonte: Laboratório do Dr. Yuri Bolshan — Instituto de Tecnologia da Universidade de Ontário
Cromatografia de camada fina (TLC) é um método cromatógrafo usado para separar misturas de compostos não voláteis. Uma placa TLC consiste em uma fina camada de material adsorbent (a fase estacionária) fixada a um suporte sólido adequado, como plástico, alumínio ou vidro1. Os compostos de amostra e referência são dissolvidos em um solvente apropriado e aplicados perto da borda inferior da placa TLC em pequenos pontos. A placa TLC é desenvolvida imergindo a borda inferior no solvente em desenvolvimento que consiste em uma fase móvel apropriada. A ação capilar permite que a fase móvel mova a camada adsorbente. À medida que o solvente move-se para cima da placa TLC, ele carrega consigo os componentes de cada ponto e os separa com base em suas interações físicas com as fases móvel e estacionária.
Principles
A cromatografia envolve a separação de uma mistura de compostos distribuindo os componentes entre duas fases2. A fase estacionária é fixada no lugar enquanto a fase móvel é permitida a fluir através da fase estacionária, carregando os componentes da mistura com ela. As propriedades de compostos como a solubilidade na fase móvel e a força de interação com a fase estacionária afetam a taxa em que são transportados através do meio. Como diferentes tipos de compostos possuem propriedades físicas diferentes, são transportados em diferentes taxas permitindo a separação dos componentes de uma mistura.
Este vídeo demonstrará a separação e visualização de misturas de compostos usando a técnica de cromatografia de camada fina unidimensional (TLC).
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Procedure
1. Placas TLC
- Adsorbents comuns para TLC são gel de sílica, alumina e celulose. As placas TLC estão disponíveis comercialmente com uma variedade de propriedades. Escolha uma placa TLC e corte-a para um tamanho apropriado (aproximadamente 5 cm x 5 cm é suficiente para a maioria das aplicações). Para placas TLC com vidro, marque o vidro usando uma régua e um cortador de vidro e, em seguida, quebre cuidadosamente ao longo da linha.
2. Manchas
- Dissolva a amostra em um solvente adequado para fazer uma solução de aproximadamente 1%. Se possível, o solvente não deve ser polar. Frações de cromatografia de coluna e outras soluções diluídos podem ser usadas sem diluição se o soluto estiver presente em uma concentração entre 0,2% e 2,0%.
- Marque a linha de base com um lápis a cerca de 1,0 cm da parte inferior da placa. Posicione as manchas a pelo menos 1,0 cm da borda da placa e rotule-as adequadamente.
- As manchas podem ser aplicadas usando um capilar de vidro. Para detectar a placa TLC, mergulhe o capilar na solução para desenhar em uma pequena quantidade de líquido. Toque suavemente na ponta para a localização desejada na placa TLC e remova-a imediatamente.
- Alternativamente, aplique manchas com uma seringa microlitera, fornecendo aproximadamente 1 μL de solução para cada aplicação.
- As manchas podem ser aplicadas sucessivamente em cada local, tomando cuidado para não perturbar a superfície do adsorente com o observador. Deixe o solvente secar entre as aplicações.
3. Escolher um solvente em desenvolvimento
- É preferível usar o menor solvente polar possível para uma boa separação. Os solventes comuns para TLC incluem hexano, acetato etílico, diclorometano e metanol(Tabela 1).
- Uma maneira conveniente de encontrar uma fase móvel apropriada é identificar a placa TLC com uma amostra. Aplique solvente suficiente diretamente no local para formar um círculo de solvente de 1 a 2 cm de diâmetro. Marque a circunferência do círculo. Após a visualização, um solvente apropriado mostrará anéis bem separados, com o anel mais externo cerca de 50% da distância do centro para a frente do solvente.
- Pode ser necessário ajustar a polaridade da fase móvel escolhendo dois solventes miscíveis e testando-os em diferentes proporções. Exemplos de misturas comuns são hexanos com acetato etílico e diclorometano com metanol.
4. Desenvolvimento
- Coloque a placa TLC manchada em uma câmara em desenvolvimento contendo o solvente em desenvolvimento apropriado. A linha de solvente deve estar abaixo da linha de base marcada na placa TLC.
- A câmara em desenvolvimento pode ser um frasco com tampa, ou um béquer coberto com papel alumínio ou filme plástico. Use o menor recipiente disponível que acomodará a placa TLC.
- Não permita que o solvente atinja a borda superior da placa. Quando a frente do solvente (o limite onde a parte úmida do adsorbent termina) estiver a 5-10 mm da parte superior da placa, retire a placa TLC da câmara em desenvolvimento e marque a frente do solvente com um lápis antes que o solvente seque.
5. Visualização
- As manchas coloridas podem ser visualizadas imediatamente e marcadas com um lápis. Muitas vezes, as manchas não são visíveis e, portanto, devem ser visualizadas por algum outro método.
- Muitas vezes, o adsorbent TLC contém um indicador fluorescente. As manchas podem ser visualizadas usando uma lâmpada ultravioleta portátil (UV). Compostos que saciam a fluorescência aparecerão como pontos escuros quando a placa estiver irradiada com luz UV de ondas curtas (254 nm). Compostos fluorescentes produzirão pontos brilhantes quando irradiados com luz UV de um comprimento de onda apropriado. Marque o centro de cada ponto com um lápis.
- As manchas também podem ser visualizadas aplicando um reagente visualizador ou mancha na placa TLC. O reagente visualizante pode ser aplicado mergulhando a placa no reagente, ou limpando a placa com uma bola de algodão saturada com um reagente não corrosivo.
- Uma solução de 20% de ácido fosfomólico no etanol é útil para a visualização da maioria dos compostos orgânicos. Os pontos aparecem após o aquecimento da placa com uma arma de calor ou em um forno.
- Outros reagentes podem ser usados para visualização de classes específicas de compostos. Por exemplo, reagente de ninidrina é usado para visualização de aminoácidos, e 2,4-dinitrophenylhydrazina para aldeídos e cetonas.
6. Análise
- O fator de retardo (Rf) é a razão da distância que um composto percorre até uma placa TLC até a distância que o solvente percorre. Isso pode ser determinado medindo a distância da linha de base para o centro da mancha e dividindo o valor pela distância da linha de base para a frente do solvente.
- O Rf de um composto é característico de suas propriedades físicas e depende de fatores como temperatura, tamanho da amostra e espessura e atividade do adsorbent, temperatura e tamanho da amostra.
- Para confirmar que um desconhecido é idêntico a um composto conhecido, um padrão deve ser visto na mesma placa TLC. Substâncias idênticas terão a mesma característica Rf.
Cromatografia de camada fina, ou TLC, é um método cromatógrafo usado para separar misturas de compostos não voláteis, comumente usados em química orgânica.
O TLC é realizado em uma placa de vidro ou plástico. Uma linha de base é marcada na placa, juntamente com rótulos. A mistura que está sendo examinada e os compostos de referência são dissolvidos em um solvente apropriado e aplicados perto da borda inferior da placa TLC em pequenos pontos. A placa é colocada em um frasco, e um solvente (a fase móvel) separa a mistura com base nas propriedades físicas de cada componente.
Apesar do fato de que técnicas de separação mais pesadas de instrumentos têm mais poder de resolução do que o TLC, é a velocidade e o baixo custo que torna o TLC uma técnica atraente para análise qualitativa on-the-fly. Este vídeo demonstrará a preparação, operação e análise da cromatografia de camada fina.
As técnicas cromatográficas incluem uma fase estacionária e móvel. No TLC, a fase estacionária consiste em uma fina camada de material fixado à placa. O material é uma substância polar, como gel de sílica. A fase móvel é um líquido não polar que move a camada adsorbent por ação capilar. À medida que a fase móvel se move para cima da placa, ela arrasta ao longo dos componentes de cada ponto, que são posteriormente separados com base na polaridade.
Compostos menos polares passarão mais tempo na fase móvel à medida que forem puxados para cima da placa. Compostos mais polares são mais atraídos para a fase estacionária e, portanto, não subirão a placa tão longe.
A separação ocorre em um recipiente em desenvolvimento. Estes podem ser frascos com tampas ou béquers cobertos com papel alumínio. Use o menor recipiente disponível que acomodará a placa TLC para acelerar a separação.
A fase móvel, ou o desenvolvimento de solvente, deve ser o mais não políxado possível para uma boa separação. Mostrado aqui é uma série eluotropica para gel de sílica, uma lista de fases móveis comuns na ordem de aumentar a potência extrativista.
Uma série de fases móveis podem ser testadas simultaneamente. Em uma placa limpa, localmente a amostra dissolvida várias vezes, com pelo menos 2 cm de distância. Aplique fase móvel suficiente em cada ponto para formar um círculo de 1-2 cm de diâmetro.
Marque a distância que a fase móvel percorre. Se a fase móvel não for polar o suficiente, a amostra permanecerá perto do local inicial. Se a fase móvel for muito polar, toda a amostra migrará com a frente do solvente. Uma fase móvel apropriada mostrará anéis bem separados, com o anel externo cerca de 50% da distância até a frente do solvente.
Se necessário, duas fases móveis miscíveis podem ser misturadas em diferentes proporções para obter as propriedades desejadas. Aqui, uma mistura de 1:1 de acetato de etila e hexano era muito polar, mas uma mistura de 1:20 foi apropriadamente separada.
Com a fase móvel escolhida, você está pronto para começar a desenvolver a placa.
Para iniciar o procedimento, corte uma placa TLC comercialmente disponível para o tamanho desejado. Se a placa tiver um apoio de vidro, marque-o com um cortador de vidro e quebre cuidadosamente ao longo da linha.
Com um lápis, marque uma linha de base a cerca de 1 cm da parte inferior da placa. Marque o local onde as amostras serão vistas ao longo da linha. Certifique-se de que as manchas estão a pelo menos 1 cm da borda e 3 mm de distância. Rotulá-los apropriadamente.
As amostras sólidas devem ser dissolvidas em um solvente adequado. Os solventes comuns incluem hexanos, acetato etílico ou diclorometano. Use o menor solvente polar que dissolva a amostra.
Elasenhe a mistura amostra/solvente com um capilar de vidro. Toque suavemente na ponta para a localização desejada na placa TLC e remova-a imediatamente. É importante não perturbar a fase estacionária.
Mantenha o local o menor possível, pois isso leva a uma melhor separação. Se for necessário mais amostra, as manchas podem ser aplicadas sucessivamente em cada local. Deixe o solvente secar entre as aplicações. Um fluxo de ar pode ser usado para secar solventes menos voláteis.
A placa TLC está pronta para ser desenvolvida. Coloque um pedaço de papel filtro na parte inferior do frasco para aumentar a pressão de vapor. Adicione a fase móvel a uma profundidade que não atinja a linha de base. Tampe o frasco quando não estiver em uso para que os vapores solventes não escapem.
Coloque cuidadosamente a placa TLC manchada no frasco em desenvolvimento. Certifique-se de que a fase móvel está abaixo da linha de base. Observe o progresso da frente solvente, a borda principal da fase móvel, pois ela se moverá rapidamente para cima da placa.
Não permita que a fase móvel atinja a borda superior da placa, pois as bandas de amostra começarão a se expandir via difusão. Uma vez que a frente do solvente se aproxime da parte superior, remova a placa da câmara em desenvolvimento e marque a frente do solvente com um lápis antes que o solvente seque.
Se os compostos não estiverem coloridos, uma lâmpada UV pode ser usada para visualizar as manchas. O composto bloqueará a fluorescência de fundo da placa. Coloque a lâmpada no ajuste de ondas curtas e ilumine a placa seca. Usando um lápis, delineie todos os pontos visíveis sob a lâmpada. Usando um lápis, delineie todos os pontos visíveis sob a lâmpada.
Outra possível técnica de visualização é o uso de permanganato de potássio, um agente oxidante. Usando pinças, mergulhe a placa na mancha de permangárnato.
Remova e retire a solução em excesso com uma toalha de papel. Em um capô de fumaça, aqueça cuidadosamente a placa com uma arma de calor para visualizar os pontos. Use um lápis para marcar as manchas que aparecerem.
Uma vez visualizadas as manchas, a substância de interesse pode ser comparada aos padrões, como mostrado aqui. Neste exemplo, o desconhecido é 1,3-difenilpropynona, um bloco de construção em síntese orgânica. Comparando a banda a um padrão conhecido e cloreto de benzoila, um dos materiais iniciais, o produto pode ser identificado.
O fator de retração, ou Rf,é usado para identificar o composto desconhecido. O Rf é a razão da distância que um composto percorre até uma placa TLC até a distância que a fase móvel percorre. O fator é determinado medindo a distância da linha de base até o local e dividindo-se pela distância da linha de base para a frente do solvente.
O Rf de um determinado composto depende das condições utilizadas no experimento, incluindo escolha de solvente, espessura e atividade do adsorbent, temperatura e tamanho da amostra. Deve-se tomar cuidado para manter esses fatores consistentes entre os experimentos.
Existem várias aplicações de cromatografia de camada fina.
Neste exemplo, foi estudado o teor de triacylgliceride das glândulas sebáceas de morcegos. A fração da superfície lipídica foi primeiramente separada pela polaridade em uma placa TLC. A banda triacylglyceride foi então removida da placa com uma espátula. O pó de sílica foi transferido para um tubo de microcentrifutura com solvente. Após a centrifugação, a fase estacionária foi deixada na parte inferior do tubo, enquanto os compostos permaneceram dissolvidos no solvente. Os triaciglicerídeos foram então separados por outra propriedade física. Neste caso, a segunda dimensão da separação foi o tamanho molecular.
TLC também pode ser usado para monitorar a progressão de uma reação química. Neste exemplo, o material inicial da reação foi usado como padrão, e correu ao lado da solução de reação em uma placa TLC. Esse processo foi repetido em intervalos específicos ao longo da reação. À medida que a reação progredia, a banda de material inicial diminuiu e a banda do produto aumentou. Quando não houve alteração nas bandas, ou todo o material inicial foi consumido, a reação foi completa.
Finalmente, as placas TLC podem ser usadas em bioensações. Neste exemplo, os compostos foram separados do trevo vermelho com TLC. Cada banda foi então colocada em bactérias crescendo em placas de ágar. Moléculas que apresentaram crescimento bacteriano inibido foram ainda mais analisadas para suas propriedades antimicrobianas.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à cromatografia de camada fina. Agora você deve entender a teoria subjacente da separação, como escolher uma fase móvel apropriada para o seu experimento e como configurar e operar uma placa TLC. Obrigado por assistir!
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Results
Um exemplo de uma placa TLC típica é mostrado na Figura 1. Um composto desconhecido 'A' pode ser comparado aos padrões conhecidos 'B' através de 'E'. A determinação do valor Rf para cada componente é alcançada através da mancha de cada composto respectivo, desenvolvendo a placa TLC e visualização. O Rf do composto desconhecido 'A' é calculado medindo a altura do ponto (y) e dividindo-se pela altura do solvente (z). Comparar esse valor com o Rf determinado para cada uma das normas permite a identificação do composto desconhecido.
Figura 1. Esquema de uma placa TLC. O fator de retardo (Rf) deve ser consistente entre os experimentos, desde que as condições sejam mantidas constantes.
Mesa 1. Série eluotropica para Gel de Sílica. Uma lista de fases móveis comuns, a fim de aumentar a energia de eluição.
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Applications and Summary
A TLC tem uma série de aplicações práticas em laboratório. O TLC pode ser usado para identificar compostos desconhecidos e componentes desconhecidos de misturas através de comparação com as normas. O TLC é comumente usado para monitorar o curso de uma reação química, e para avaliar a pureza do produto através da comparação de quantidades relativas de reagentes, produtos e subprodutos em cromatografias sucessivas ao longo do tempo. O TLC também pode ser usado para determinar se uma substância purificada por outros métodos (como recristallização ou destilação) ainda contém uma quantidade significativa de impureza.
Quando compostos semelhantes não podem ser resolvidos com TLC, eles podem ser separados com base em outra propriedade física, conhecida como separação bidimensional. Em um exemplo, o TLC foi usado para separar classes lipídicas amplas (triglicérides, esteróis, ácidos graxos, etc.) secretados por glândulas sebáceas mamíferas. As diferentes classes foram então separadas pela espectrometria de massa3.
Na microbiologia, o TLC é usado em triagens bioautografias para novos compostos antimicrobianos à base de plantas4. Uma vez separados dos compostos de um extrato da planta em questão, as bandas podem ser aplicadas diretamente às culturas microbianas. Bandas que são observadas para inibir o crescimento são então mais estudadas como prováveis candidatos.
TLC é um método simples para determinar uma fase móvel apropriada para a separação de uma mistura por cromatografia de coluna. Além disso, é utilizado para determinar a composição das várias frações coletadas durante a separação da cromatografia da coluna, para que as frações contendo o composto desejado possam ser identificadas e coletadas.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
References
- Lehman, J. W. The student's lab companion: laboratory techniques for organic chemistry: standard scale and microscale. Pearson College Div, (2008).
- Pavia, D. L., Lampman, G. M., Kriz, G. S., & Engel, R. G. Microscale and Macroscale Techniques. Thomson Wadsworth, (2006).
- Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, (2013).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (85), e51411, (2014).
