Overview
Genetischen Bildschirme sind wichtige Werkzeuge für Genfunktion zu definieren und Gen-Interaktionen zu verstehen. Bildschirme typischerweise Gene mutiert und dann bewerten die betroffenen Organismen für Phänotypen von Interesse. Der Prozess kann "nach vorn" sein, wo Mutationen sind zufällig generiert, um unbekannte Gene verantwortlich für die Phänotypen zu identifizieren, oder kann es sein, "reverse", wo bestimmte Gene Mutation zu beobachten, welche Phänotypen entstehen ausgerichtet sind.
JoVE Bewertungen hier, verschiedene Arten von genetischen Bildschirme, einschließlich derjenigen, die auf Verlust der Funktion oder Gain-of-Function-Mutationen, welche bzw. verringern oder erhöhen die Aktivität von Genen. Dann erkunden wir allgemeine Protokolle für vorwärts- und Rückwärtsfahrt Bildschirme in beliebter Modellorganismus, die Nematoden Wurm. Schließlich betonen wir, wie Bildschirme in der Forschung heute angewendet werden zum Beispiel um gen-Interaktionen besser zu verstehen, die zu neurodegenerativen Erkrankungen beitragen können.
Procedure
Genetischen Bildschirme sind wichtige Instrumente zur Identifizierung von Genen und Mutationen für Phänotypen von Interesse und für das Verständnis der Funktionsweise von Genen in biologische Prozesse verantwortlich. Bildschirme werden in verschiedenen Modellsysteme, fliegen, Würmer, Pflanzen und Zellkultur, einschließlich durchgeführt und führten zu die Entdeckung der neuen zelluläre Signalwege und mögliche Angriffspunkte für menschliche Krankheiten.
Dieses Video wird geben einen Überblick über die verschiedenen Arten von genetischen Bildschirme, zwei allgemeine Protokolle für Bildschirme in Fadenwürmer zu erklären und zeigen, dass heute einige Möglichkeiten Bildschirme in Laboren angewendet werden.
Zuerst lassen Sie uns einen Blick auf welche genetischen Bildschirme sind und was wir von ihnen lernen können.
Genetische-Bildschirme basieren auf entweder vorwärts oder rückwärts Genetik. In einem nach vorn oder "klassische" genetischen Bildschirm sind Mutationen in einem Organismus DNA mit Strahlung oder Chemikalien bekannt als erbgutverändernd zufallsgeneriert. Weitere Grundlagen können auch eingefügt werden, in DNA mit Hilfe beispielsweise Sequenzen bekannt als Transposons, die an verschiedenen Stellen im Genom zu integrieren und stören die Funktion der Gene, die sie einfügen, können. Diese Arten von Einfügungen sind oft mit fluoreszierenden Reporter ermöglichen direkte Nachweis der mutierten Organismen gekoppelt. Wenn eine Mutante gefunden wird, um einen Phänotyp des Interesses anzuzeigen, kann unbekannte Gens mutiert war dann ein Chromosom zugeordnet und sequenziert.
Der umgekehrte Weg zum Screening ist ein reverse genetische Bildschirm, wo Forscher stören den Ausdruck von vielen Kandidatengenen und suchen Sie dann nach mutierten Phänotypen, die durch diese Manipulationen.
Neben "Verlustfunktion" Mutationen, die eine Genaktivität stören, können genetische Bildschirme auch auf "Gain of Function" Mutationen, basieren, die dazu führen, dass ein Gen Ausdruck oder Funktionalität zu erhöhen. Dies kann durch Einfügen von nach dem Zufallsprinzip gen regulatorischen Elemente in das Genom, die fahren würde die Überexpression des Gens, das das Element fügt stromaufwärts von.
Stellen Sie alternativ in eine Methode namens "Ausdruck Screening", Forscher der Bibliotheken der Plasmide, die die Protein-kodierenden Sequenzen von verschiedenen Genen enthalten verwenden, und führen sie in Zellen, wo die Gene hoch zum Ausdruck gebracht wird. Daraus resultierenden Phänotypen lässt dann Genfunktion zu verstehen.
Um mehr Informationen zu einem bekannten gen oder Mutation zu entdecken, können Modifikator Bildschirme verwendet werden. Ein Suppressor-Bildschirm beginnt mit gekennzeichneten Mutant und identifiziert weitere Mutationen, die die mutierten Phänotyp weniger stark machen. Eine Schutzbeschaltung Mutation gefunden im gleichen gen wie die ursprüngliche Mutation als "intragenic" genannt wird, während eine Suppressor-Mutation befindet sich in einem anderen gen gilt als "Stents".
Im Gegensatz dazu identifizieren Enhancer Bildschirme zusätzliche Mutationen, die die schwere eines mutierten Phänotyps erhöhen. Diese können für die Bestimmung von Genen, die überflüssig sind oder funktional interagieren können hilfreich sein. Wenn die Kombination von zwei oder mehr Mutationen zu stark beeinträchtigt Wachstum oder sogar zum Tod führt, die Bedingung genannt "synthetische Krankheit oder Tödlichkeit." Ein Bildschirm für synthetische krank oder tödliche Mutationen zeigt Gene, die in überflüssig, sondern unerlässlich, funktionieren biologischer Signalwege. Dies ist besonders nützlich, z. B. bei der Identifizierung mehrerer Genprodukte, die gleichzeitig mit Medikamenten, Krebszellen zu töten ausgerichtet werden können.
Jetzt, wo Sie einige gemeinsame genetisches Screening-Strategien verstehen, betrachten wir ein allgemeines Protokoll für einen vorderen Bildschirm in beliebter Modellorganismus, die Nematoden Wurm.
In diesem Beispiel wird chemische Mutagenese mit Ethyl Methanesulfonate oder EMS, die Werke von Guanin Nukleotide chemisch zu ändern, wodurch sie unangemessen mit Thymin in den folgenden Runden der DNA-Replikation durchgeführt werden. Weil EMS ein Mutagen und ein mögliches Karzinogen ist, behandelt werden, nur, wenn eine doppelte Schicht von Handschuhe tragen und arbeiten unter einem Abzug durchgeführt werden.
Um zu beginnen, sind große Anzahl von Würmern im letzten Larvenstadium ausgewählt, gewaschen und gesammelt. EMS wird dann hinzugefügt, die Würmer und die Würmer werden für mehrere Stunden, um Mutationen induzieren inkubiert. Nach Mutagenese sollte EMS entfernt die Würmer und mit Natriumhydroxid inaktiviert werden. Würmer sind dann mehrere Male im Wachstumsmedium gewaschen und auf Agarplatten vernickelt.
Nächste, gesund aussehende Würmer sind an neuen Platten frisch ausgesät mit Bakterien als Nahrungsquelle übertragen und erlaubt zu reproduzieren. Zweite Generation nachkommen können visuell auf mutierte Phänotypen, wie Lok Mängel untersucht werden.
Nun, gehen Sie wir durch ein Protokoll für eine umgekehrte genetischen Bildschirm in Nematoden.
Ein gemeinsames Konzept zur Durchführung von reverse Bildschirme in Worms ist es, die Tiere zu füttern, eine Bibliothek von Bakterien mit dem Ausdruck doppelsträngige RNA, eine pro Bakterienstamm, denen der Ausdruck von einem Kandidaten gen in den Würmern niederschlagen wird. Diese Bibliotheken sind oft im Handel erhältlich und können Sub für den Einsatz in Bildschirmen kultiviert werden.
Um zu beginnen, sind einzelne Kolonien von Bakterien, enthält einzelne Bibliothek Klone kultiviert und doppelsträngige RNA Produktion induziert wird. Kulturen sind dann auf separaten Brunnen einer Platte mit Nematoden Wachstumsmedium entdeckt und in einem sterilen Abzug getrocknet.
Als nächstes sind Würmer vergoldet auf die Bakterien und in eine feuchte Kammer für drei bis vier Tage füttern durfte. Entweder in der ursprünglichen Würmer auf die Fütterungen Platten gelegt oder Nachkommen der ersten Generation können schnell mutierte Phänotypen beobachtet.
Nun, du wie vorwärts gesehen hast und rückwärts genetische Bildschirme durchgeführt sind, sprechen wir über einige ihrer aktuellen Anwendungen.
Einige genetische Bildschirme werden verwendet, um Wissenschaftler identifizieren Proteine, die physisch interagieren oder Funktion in dem gleichen molekularen Weg zu helfen. In diesem Experiment ausgedacht Wissenschaftler einen Hochdurchsatz-Mikroskopie-basierten Bildschirm um neuartige transmembranen Rezeptoren zu entdecken, die ein bestimmtes Signalmolekül aktivieren. Durch eine Vielzahl von Genen im menschlichen embryonalen Nierenzellen, enthält das Eindringmittel tagged überexprimierenden Signalisierung Protein, Monitor konnten welche Rezeptoren subzelluläre Lokalisation des Proteins beeinflussen.
Eine weitere Anwendung der genetischen Screening ist die Charakterisierung der gen-Arzneimittel-Wechselwirkungen. Hier wurde eine mutierte Hefe-Bibliothek mit groß angelegten zufällige Mutagenese mit Transposon Einfügungen erstellt. Jede Mutante wurde dann im Beisein eines Medikaments angebaut. Das Wachstum von jedem Stamm war quantifizierte mittels PCR gefolgt von Microarrays oder Sequenzierung Analyse um zu bestimmen, welche durch Mutation entstehende Variationen, im Vergleich zu Krebszelle Kontrollen, waren empfindlich auf die medikamentöse Behandlung.
Zu guter Letzt können Bildschirme verwendet werden, zu verstehen, die Gene und molekulare Netzwerke in der menschlichen Krankheit gestört. Forscher in diesem Experiment kultivierten Neuronen im Beisein von RNA-Codierung Viren Knockdown Ausdruck von vielen verschiedenen Zielgenen. Automatisierte Analyse von Immunostained Zellen wurde dann verwendet, um Gene zu offenbaren, die physikalische Eigenschaften der Neuronen, wie z. B. Neuriten Auswuchs beeinflussen. Dieser Ansatz hat erfolgreich bei neurodegenerativen Erkrankungen beteiligten Gene identifiziert.
Sie habe nur beobachtet, Jupiter-video auf genetische Bildschirmen – eine leistungsfähige Technik für die Aufdeckung der Gene wichtige biologische Prozesse beteiligt. In diesem Video wir überprüft einige Haupttypen von genetischen Bildschirme, allgemeine Protokolle, beide führen nach vorne und umkehren Bildschirme und diskutiert, wie diese Methoden heute in Laboren angewendet werden. Danke fürs Zuschauen!
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