Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 

Overview

유전 스크린은 유전자 기능을 정의하고 유전자 상호 작용을 이해하기 위한 중요한 도구입니다. 스크린은 전형적으로 유전자를 돌연변이하고 관심의 표현형을 위한 영향 받은 유기체를 평가하는 관련시킵니다. 이 과정은 표현형에 책임이 있는 알려지지 않은 유전자를 식별하기 위해 돌연변이가 무작위로 생성되는 "전진"일 수 있거나, 특정 유전자가 어떤 표현형이 생성되는지 관찰하기 위해 돌연변이를 표적으로 하는 "역"일 수 있다.

여기에서 JoVE는 유전자의 활동을 각각 감소하거나 증가하는 기능 상실 또는 기능 성 돌연변이에 의존하는 유전자 스크린의 다양한 유형을 검토합니다. 그런 다음 인기있는 모델 유기체인 선충 벌레에서 전방 및 역방향 스크린을 위한 일반적인 프로토콜을 살펴봅시다. 마지막으로, 우리는 스크린이 신경 퇴행성 질병에 기여할 수 있는 유전자 상호 작용을 더 잘 이해하기 위하여 예를 들면, 예를 들면, 오늘 연구에서 어떻게 적용되는지 강조합니다.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

유전 적 스크린은 관심의 표현형에 책임 있는 유전자 와 돌연변이를 확인하고, 유전자가 생물학 프로세스에서 어떻게 작동하는지 이해하기 위한 중요한 공구입니다. 스크린은 파리, 벌레, 식물 및 세포 배양을 포함하여 다양한 모형 시스템에서 수행되고, 인간 적인 질병을 위한 새로운 세포 통로 및 잠재적인 약 표적의 발견으로 이끌어 냈습니다.

이 비디오는 유전 스크린의 다른 모형의 개요를 제공하고, 선충 벌레에 있는 스크린을 위한 2개의 일반적인 프로토콜을 설명하고, 스크린이 오늘 실험실에서 적용되는 몇몇 쪽을 보여줍니다.

먼저, 유전 적 화면이 무엇이며 우리가 그들로부터 무엇을 배울 수 있는지 살펴 보겠습니다.

유전 스크린은 전진 또는 역 유전학을 기반으로 합니다. 전진 또는 "고전적인"유전 화면에서 돌연변이는 돌연변이로 알려진 방사선 또는 화학 물질을 사용하여 유기체의 DNA에서 무작위로 생성됩니다. 추가 기지는 또한 게놈 내의 다른 위치에 통합하고 삽입하는 유전자의 기능을 방해할 수 있는 transposons로 알려져 있는 서열을 사용하여 DNA로 삽입될 수 있습니다. 이러한 유형의 삽입은 돌연변이 된 유기체의 직접 검출을 가능하게하기 위해 형광 기자와 종종 결합됩니다. 돌연변이가 관심표현형을 표시하는 것으로 밝혀지면 돌연변이된 알 수 없는 유전자는 염색체에 매핑되고 시퀀스될 수 있다.

스크리닝에 대한 반대 접근법은 연구원이 많은 후보 유전자의 발현을 방해하고 이러한 조작으로 인한 돌연변이 표현형을 찾는 역유전 화면입니다.

유전자의 활동을 방해하는 "기능 상실" 돌연변이 이외에, 유전 스크린은 또한 유전자의 발현 또는 기능이 증가하는 원인이 되는 "기능의 이득" 돌연변이에 근거할 수 있습니다. 이것은 원소가 상류에 삽입하는 유전자의 과발현을 유도할 게놈에 유전자 조절 요소를 무작위로 삽입해서 달성될 수 있습니다.

대안적으로, "발현 스크리닝"이라고 칭한 방법으로, 연구원은 각종 유전자의 단백질 코딩 서열을 포함하는 plasmids의 라이브러리를 이용하고, 유전자가 높게 표현될 세포로 그(것)들을 소개합니다. 결과 표현형은 유전자 기능을 이해하기 위하여 그 때 이용될 수 있습니다.

알려진 유전자 또는 돌연변이에 대한 자세한 정보를 밝히기 위해 수정자 화면을 사용할 수 있습니다. 억제기 화면은 특징적인 돌연변이로 시작하여 돌연변이 표현형을 덜 심각하게 만드는 추가 돌연변이를 식별합니다. 원래 돌연변이와 같은 유전자에서 발견되는 억제제 돌연변이는 "내성"으로 지칭되는 반면, 다른 유전자에 있는 억제제 돌연변이는 "외성"으로 간주됩니다.

대조적으로, 증강 스크린은 돌연변이 표현형의 엄격을 증가시키는 추가 돌연변이를 확인합니다. 이들은 중복되거나 기능적으로 상호 작용할 수 있는 유전자를 결정하기 위해 도움이 될 수 있습니다. 두 개 이상의 돌연변이의 조합이 가혹하게 손상된 성장 또는 죽음에서 유래하는 경우에, 조건은 "합성 병 또는 치사성"이라고 합니다. 합성 아픈 또는 치명적인 돌연변이에 대 한 화면 중복에서 작동 하는 유전자를 밝혀, 하지만 필수적인, 생물학적 경로. 이것은 특히 유용, 예를 들어, 동시에 암세포를 죽일 약물과 대상으로 할 수 있는 여러 유전자 제품을 식별.

이제 몇 가지 일반적인 유전자 선별 전략을 이해하게 되었으므로 인기있는 모델 유기체인 선충 벌레의 전방 스크린에 대한 일반적인 프로토콜을 살펴 보겠습니다.

이 예에서, 화학 돌연변이 발생은 화학적으로 구아닌 뉴클레오티드를 수정하여 작동하는 에틸 메탄술포네이트 또는 EMS로 수행되어 DNA 복제의 후속 라운드에서 티민과 부적절하게 쌍을 이룬다. EMS는 돌연변이원과 발암물질이므로 장갑의 이중 층을 착용할 때만 처리되어야 하며 연기 후드에서 작업을 수행해야 합니다.

우선, 마지막 애벌레 단계에서 많은 수의 벌레가 선택, 세척 및 수집됩니다. EMS는 벌레에 추가되고, 벌레는 돌연변이를 유도하기 위하여 몇 시간 동안 배양됩니다. 돌연변이 발생 에 따라, EMS는 벌레에서 제거하고 나트륨 수산화나트륨으로 비활성화해야합니다. 벌레는 성장 매체에서 여러 번 세척하고 천판에 도금됩니다.

다음으로, 건강한 벌레는 식품 공급원으로 박테리아로 갓 씨를 뿌려 서 번식할 수 있는 새로운 접시로 옮겨집니다. 2세대 자손은 기관차 결함과 같은 돌연변이 표현형을 시각적으로 선별할 수 있다.

이제 선충의 역 유전 적 화면에 대한 프로토콜을 살펴보겠습니다.

벌레에서 역스크린을 수행하는 일반적인 접근법은 동물에게 이중 좌초 된 RNA를 표현하는 박테리아 라이브러리를 먹이는 것입니다. 이러한 라이브러리는 종종 시판되고 화면에서 사용하기 위해 하위 배양 될 수 있습니다.

시작하려면, 개별 라이브러리 클론을 포함하는 박테리아의 단일 식민지가 배양되고, 이중 좌초 RNA 생산은 유도된다. 배양은 선충 성장 매체를 가진 접시의 분리된 우물에 그 때 발견되고 멸균 연기 후드에서 건조할 수 있습니다.

다음으로, 벌레는 박테리아에 도금되고 3 4 일 동안 가습 챔버에서 공급할 수 있습니다. 돌연변이 표현형은 급식 플레이트에 놓인 원래 벌레또는 1세대 자손에서 신속하게 관찰될 수 있다.

이제 유전자 화면이 어떻게 수행되는지 보았으니 현재 의 일부 응용 프로그램에 대해 살펴보겠습니다.

몇몇 유전 스크린은 과학자가 물리적으로 상호 작용하거나 동일 분자 통로에서 작동하는 단백질을 확인하는 것을 돕기 위하여 이용됩니다. 이 실험에서 과학자들은 특정 신호 분자를 활성화하는 새로운 막 수용체를 발견하기 위해 고처리량 현미경 기반 화면을 고안했습니다. 형광 태그 신호 단백질을 포함하는 인간 배아 신장 세포에서 유전자의 다양한 과발현함으로써, 그들은 단백질의 세포 외 국소화에 영향을 미치는 수용체를 모니터링 할 수 있었다.

유전자 검열의 또 다른 응용은 유전자 약 상호 작용의 특성입니다. 여기서, 돌연변이 효모 라이브러리는 트랜스포슨 삽입을 이용한 대규모 무작위 돌연변이 발생을 사용하여 생성되었다. 각 돌연변이 균주는 약물의 존재에서 다음 성장했다. 각 균주의 성장은 PCR을 사용하여 정량화되었고, 그 다음에는 미세 어레이 또는 시퀀싱 분석이 그 다음에 돌연변이되지 않은 대조군과 비교하여 약물 치료에 민감하게 반응한 돌연변이를 결정하였다.

마지막으로, 스크린은 인간 적인 질병에서 중단된 유전자 및 분자 네트워크를 이해하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 실험에 있는 연구원은 많은 다른 표적 유전자의 녹다운 발현에 RNA 인코딩 바이러스의 존재에 있는 뉴런을 배양했습니다. 면역 스테인드 세포의 자동화 된 분석은 뉴런의 물리적 특성에 영향을 미치는 유전자를 밝히기 위해 사용되었다, 신경질적 아웃 성장과 같은. 이 접근법은 성공적으로 신경 퇴행성 질환에 관련된 유전자를 확인했다.

당신은 유전 화면에서 JoVE의 비디오를 보았습니다 - 주요 생물학적 과정에 관련된 유전자를 밝히기위한 강력한 기술입니다. 이 비디오에서는 몇 가지 주요 유형의 유전 화면, 전방 및 역스크린을 모두 수행하는 일반적인 프로토콜을 검토하고 이러한 방법이 오늘날 실험실에서 어떻게 적용되는지 논의했습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter