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Genotipizzazione SNP

Overview

I polimorfismi a singolo nucleotide, o SNP, sono la forma più comune di variazione genetica negli esseri umani. Queste differenze alle singole basi nel DNA spesso non influenzano direttamente l'espressione genica, ma in molti casi possono ancora essere utili per localizzare i geni associati alla malattia o per diagnosticare i pazienti. Sono state stabilite numerose metodologie per identificare, o "genotipizzare", gli SNP.

L'introduzione di JoVE alla genotipizzazione SNP inizia discutendo cosa sono gli SNP e come possono essere utilizzati per identificare i geni associati alla malattia. Vengono quindi esaminati diversi metodi comuni di genotipizzazione SNP, tra cui l'ibridazione diretta, i metodi basati sulla PCR, l'analisi dei frammenti e il sequenziamento. Infine, presentiamo diversi esempi di come queste tecniche sono applicate alla ricerca genetica oggi.

Procedure

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La variazione genetica si verifica sia all'interno che tra diverse popolazioni e contribuisce alla variazione dei tratti, compresa la suscettibilità alle malattie, tra gli individui. Le variazioni più comuni sono i polimorfismi a singolo nucleotide, o SNP. La genotipizzazione SNP comporta la determinazione degli insiemi specifici di varianti, in questo caso SNP, presenti in un individuo.

Questo video discuterà alcuni dei principi alla base della genotipizzazione SNP, fornirà un'introduzione a diversi metodi comuni di identificazione SNP e, infine, alcune applicazioni di queste tecniche.

Innanzitutto, discutiamo cos'è un SNP e come può essere utilizzato nella genotipizzazione.

I "polimorfismi" sono alleli, o diverse versioni di un locus genetico, che si trovano ad una frequenza apprezzabile all'interno di una popolazione, e includono sostituzioni di base e inserzioni o delezioni. I polimorfismi a singolo nucleotide sono variazioni in una singola base di DNA. Gli SNP possono verificarsi in tutto il genoma e la maggior parte non altera la struttura proteica o l'espressione genica. Tuttavia, possono ancora essere associati a malattie a causa della loro vicinanza fisica, o "collegamento", a una variante genetica che causa la malattia. D'altra parte, ci sono diversi SNP di spicco che sono noti per causare direttamente malattie come la fibrosi cistica, l'anemia falciforme e la β-talassemia.

Un'applicazione pratica per la genotipizzazione SNP è la medicina personalizzata, in cui l'identificazione di SNP associati a malattie o con risposte differenziali a un farmaco o a una terapia può aiutare i medici a diagnosticare e trattare meglio i pazienti.

Gli SNP sono utili anche per gli studi di associazione a livello di genoma, che esaminano centinaia di migliaia di SNP attraverso l'intero genoma per identificare quelli associati a tratti o malattie. GWAS sfrutta gruppi di SNP noti come "aplotipi". Gli SNP all'interno di un aplotipo sono in "squilibrio di linkage", il che significa che la particolare combinazione di varianti ha maggiori probabilità di verificarsi insieme di quanto previsto per caso, spesso il risultato della loro vicinanza fisica su un cromosoma. Ciò significa che gli aplotipi possono essere differenziati genotipizzando solo un piccolo numero di singoli SNP, rendendo gli studi di associazione genetica meno costosi o laboriosi.

Dopo aver esaminato cosa sono gli SNP e come possono essere utilizzati, esaminiamo alcune delle numerose metodologie che sono state sviluppate per genotipizzare gli SNP. Questi includono l'ibridazione diretta, i metodi basati sulla PCR, l'analisi dei frammenti e il sequenziamento.

Le tecniche di ibridazione diretta come gli array SNP utilizzano brevi sonde oligonucleotidiche per identificare direttamente i singoli SNP. Centinaia di migliaia di SNP possono essere testati su un singolo biochip. Le sonde sono fissate chimicamente alla matrice del chip, tipicamente un vetrino. Per rilevare gli SNP in un campione, il DNA genomico isolato viene amplificato dalla PCR e frammentato per migliorare l'efficienza di legame della sonda. Il DNA viene quindi etichettato, in genere con un marcatore fluorescente, seguito dall'ibridazione al chip. Dopo che il DNA campione è stato autorizzato a legarsi alle sonde, tutto il DNA non legato o non specificamente legato viene lavato via. Misurando il segnale in ogni punto della sonda, è possibile determinare la presenza dell'allele bersaglio nel campione.

Un altro metodo di tipizzazione SNP è la PCR allele-specifica, in cui i primer sono progettati contro sequenze contenenti SNP in modo che si ibridizzino solo con l'allele perfettamente complementare. I prodotti PCR possono essere rilevati con metodi come i tag fluorescenti. In alternativa, i primer PCR che fiancheggiano il sito di interesse SNP possono essere progettati in combinazione con una sonda specifica per SNP, come nel test TaqMan PCR. Qui, la sonda contiene un marcatore fluorescente, così come una molecola quencher che sopprime la fluorescenza dal marcatore vicino. Durante la PCR, solo la sequenza di sonda specificamente legata sarà degradata dall'attività di esonucleasi di 5′ della polimerasi, separando il tag fluorescente dal quencher e risultando in un segnale fluorescente che indica la presenza della particolare variante.

Una terza categoria di metodi, chiamata analisi dei frammenti, prevede la creazione di frammenti di DNA di varie dimensioni o etichette, in base alla presenza o all'assenza di un particolare SNP. L'analisi del polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione sfrutta la stretta specificità delle endonucleasi di restrizione per le loro sequenze target, in cui un allele è scisso e l'altro no. Il test di legatura utilizza due sonde situate direttamente l'una accanto all'altra, una delle quali termina alla base SNP target. Se la sonda contenente SNP si lega perfettamente, può verificarsi la legatura. Il test di estensione del primer coinvolge primer che legano un nucleotide a corto dell'SNP bersaglio. Questo primer viene quindi esteso in modo variabile in base al singolo allele presente. I frammenti generati da questi metodi possono quindi essere differenziati mediante elettroforesi su gel o capillare o spettrometria di massa.

Infine, il sequenziamento può rilevare gli SNP in modo molto specifico, nonché identificare nuovi SNP con sequenze sconosciute. Tuttavia, è necessario prestare particolare attenzione e repliche sperimentali aggiuntive per distinguere gli SNP effettivi dagli errori di lettura di sequenziamento. Man mano che le tecnologie di sequenziamento diventano più economiche e più accessibili, i ricercatori utilizzano sempre più il sequenziamento per la genotipizzazione.

Dopo aver visto come gli SNP possono essere genotipizzati, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni specifiche per queste tecniche.

La genotipizzazione può essere utilizzata per distinguere tra varietà di una specie con aspetto quasi identico. Ciò si ottiene isolando prima il DNA genomico, seguito dalla PCR utilizzando primer progettati per legare sequenze con SNP noti o altre varianti genetiche. Questi primer amplificheranno solo il DNA della varietà contenente il polimorfismo specifico, e quindi possono essere utilizzati per distinguere tra questi sosia.

I ricercatori usano anche la genotipizzazione per identificare i batteri patogeni che ospitano specifiche mutazioni di resistenza ai farmaci. Un protocollo di array SNP semplificato per impostazioni a bassa risorsa viene stabilito aggiungendo DNA genomico e master-mix PCR direttamente a un chip. L'amplificazione e l'ibridazione del campione avvengono in un unico passaggio. Gli array vengono quindi lavati, ripresi e i risultati vengono analizzati per determinare la presenza o l'assenza di batteri della tubercolosi, nonché eventuali mutazioni resistenti ai farmaci.

Infine, gli SNP possono essere utilizzati per valutare la funzione delle varianti genetiche che aumentano il rischio di malattia mediante studi di associazione. Qui, gli scienziati hanno sperimentato una linea cellulare eterozigote per un SNP "marcatore" neutro situato nella porzione trascritta di un gene di interesse, nonché un SNP di test non trascritto associato alla malattia. Viene scelta una linea cellulare di controllo negativa che è eterozigote per il marcatore SNP, ma omozigote per la variante non associata alla malattia del test SNP. L'estensione del primer allele-specifico è stata eseguita sul DNA genomico, così come il cDNA inverso trascritto dall'mRNA espresso. I prodotti di estensione del primer sono stati quindi quantificati utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF. Confrontando l'abbondanza relativa dei frammenti associati ai due alleli SNP marcatori, i ricercatori possono determinare se l'SNP associato alla malattia provoca una ridotta espressione genica.

Hai appena visto il video di JoVE sulla genotipizzazione SNP. Questo video ha introdotto il concetto e gli usi degli SNP, diversi metodi di base utilizzati per identificare e caratterizzare gli SNP e ha evidenziato tre applicazioni della genotipizzazione SNP. Come sempre, grazie per aver guardato!

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