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Overview

La citogenetica è il campo di studio dedicato ai cromosomi e comporta l'osservazione diretta del numero e della struttura cromosomica di una cellula, insieme noti come cariotipo. Molte anomalie cromosomiche sono associate alla malattia. Ogni cromosoma in un cariotipo può essere macchiato con una varietà di coloranti per dare modelli di banding unici. Tecniche più recenti, tra cui l'ibridazione genomica comparativa e l'ibridazione fluorescente in situ (FISH), consentono di rilevare caratteristiche o anomalie cromosomiche specifiche.

Questo video inizierà esaminando i principi di queste tecniche di citogenetica classiche e moderne. Questo è seguito da un esame di un protocollo generale per l'esecuzione di FISH. Infine, vengono presentati diversi esempi di come il cariotipo può essere applicato a varie applicazioni mediche.

Procedure

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La citogenetica è lo studio della struttura e delle proprietà dei cromosomi, nonché del loro comportamento durante la divisione cellulare e del loro ruolo nell'ereditarietà. Un cromosoma, che è una molecola di DNA e delle sue proteine associate, può essere osservato al microscopio con l'aiuto di coloranti e sonde. Tali osservazioni sono un approccio potente per rilevare difetti nella struttura e nel numero cromosomico, che sono spesso associati a malattie e disturbi.

Questo video coprirà i principi della citogenetica, un protocollo per una tecnica ampiamente utilizzata per evidenziare caratteristiche cromosomiche specifiche, nota come ibridazione fluorescente in situ, e alcune applicazioni di questa tecnica.

Iniziamo discutendo l'importanza della citogenetica e i principi alla base di alcune tecniche classiche e moderne nel campo.

La citogenetica comporta l'osservazione diretta della struttura e del numero cromosomico di una cellula, noto come "cariotipo". Può essere usato per rilevare deviazioni dal normale numero cromosomico diploide o accoppiato, che viene definito aneuploidia, nonché difetti nella struttura cromosomica.

Molte malattie e disturbi derivano da anomalie cromosomiche. Ad esempio, il cromosoma Philadelphia, che deriva da una traslocazione reciproca tra parti dei cromosomi 9 e 22, è associato a leucemia mieloide cronica. Un altro esempio è la Trisomia 21, la causa più comune della sindrome di Down, in cui viene ereditata una copia extra del cromosoma 21.

Il cariotipo viene solitamente eseguito su cellule che si preparano a dividersi, quando i loro cromosomi sono condensati e possono essere facilmente distinti.

I cromosomi in un cariotipo possono essere trattati con macchie che rivelano modelli di bande distintivi. I cromosomi colorati possono quindi essere disposti per dimensione e forma per l'analisi del cariotipo. Diversi coloranti possono essere applicati per evidenziare caratteristiche cromosomiche specifiche. La colorazione con Giemsa, o G-banding, segna regioni densamente imballate, solitamente povere di geni, ricche di basi A-T. R-banding è una macchia di Giemsa inversa che evidenzia le regioni cromosomiche ricche di basi G-C. Il C-banding evidenzia le regioni cromosomiche più dense attorno al centromero, la struttura che unisce le metà identiche di un cromosoma duplicato, mentre il T-banding evidenzia le estremità dei cromosomi o telomeri.

Un'altra tecnica, chiamata ibridazione fluorescente in situ, o FISH, consente il rilevamento di cromosomi specifici, regioni del DNA o trascritti di RNA. Ciò si ottiene incubando un campione con sonde oligonucleotidiche altamente specifiche che sono etichettate in modo fluorescente. Poiché queste sonde possono essere ibridate a cromosomi non condensi in cellule non in divisione, fish può essere applicato in modo più ampio rispetto ai metodi classici di cariotipizzazione.

Infine, i ricercatori hanno anche sviluppato un metodo chiamato ibridazione genomica comparativa per lo screening delle regioni cromosomiche mancanti o duplicate. Il DNA genomico di un soggetto di test e controllo viene isolato, frammentato ed etichettato con fluorofori di colore diverso. I preparati genomici frammentati vengono quindi miscelati e ibridati in modo competitivo a una normale diffusione cromosomica. I colori sul cariotipo risultante indicano se una regione è duplicata nel campione di prova, che genera più frammenti per legare la diffusione, o se la regione viene eliminata, con conseguente legame preferenziale ai frammenti di controllo più abbondanti.

Ora che hai compreso i principi della citogenetica, mettiamoli in pratica e diamo un'occhiata più da vicino a come viene eseguita la FISH.

In primo luogo, i tessuti o le cellule isolate vengono trattati con un fissativo come la paraformaldeide per preservare la morfologia e l'integrità cromosomica. Successivamente, viene preparata una diffusione cromosomica, ad esempio interrompendo meccanicamente il materiale. I cromosomi vengono quindi disidratati in una serie di soluzioni di concentrazioni crescenti di etanolo e permeabilizzati in una soluzione di pepsina per rendere le sequenze target più accessibili alle sonde. I cromosomi vengono poi lavati e stabilizzati con un postfix, denaturati con formammide in modo che il DNA ormai a singolo filamento possa legare le sonde e disidratati in una seconda serie di soluzioni di etanolo sempre più concentrate.

Le sonde di DNA altamente specifiche etichettate fluorescenti vengono preparate e mescolate con frammenti di DNA ripetitivi non etichettati per bloccare il legame non specifico. La sonda viene quindi applicata alla diffusione cromosomica, dove si ibrida alla sua sequenza target e la sonda non legata viene rimossa con una serie di lavaggi.

Infine, i cromosomi sono montati in un mezzo che conserva il campione e contiene una controstain generale del DNA, come il DAPI che etichetta il DNA genomico di fondo, e viene applicato un coverslip. A questo punto, i campioni possono essere osservati al microscopio a fluorescenza utilizzando gli appositi set di filtri per visualizzare il DNA genomico e le caratteristiche specifiche della sequenza.

Dopo aver visto come viene eseguito il FISH, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni di questa potente tecnica.

Fish può essere usato per confermare che il cariotipo di un embrione è normale prima dell'impianto. Qui, una singola cellula, nota come blastomero, è stata biopsia da un embrione tre giorni dopo la fecondazione, quindi lisata e fissata direttamente su un vetrino per microscopio. La diffusione cromosomica è stata poi ibridata a sonde appositamente selezionate per identificare potenziali disturbi cromosomici. In questo caso, le deviazioni dal modello atteso dei segnali di ibridazione indicano interruzioni nel numero o nella struttura cromosomica.

Sono state inoltre sviluppate tecniche innovative per etichettare tutti i cromosomi da un singolo campione biologico. Uno di questi metodi prevede il dispositivo Octochrome, un vetrino a otto celle precaricato con sonde fluorescenti. Tutti i 22 cromosomi che determinano il sesso, chiamati autosomi, e i due cromosomi sessuali sono stati etichettati distribuendoli tra le otto finestre, ciascuna contenente tre fluorofori cromosomici specifici. Ciò ha permesso lo screening simultaneo di tutti i cromosomi da una singola ibridazione.

Infine, piuttosto che separare le sonde in diverse finestre su una diapositiva, tutti i cromosomi possono essere etichettati e quindi rilevati insieme utilizzando un approccio chiamato cariotipo spettrale o SKY. Più sonde cromosomiche specifiche con diverse etichette fluorescenti sono state ibridate a ciascun cromosoma, dando a ciascuno un colore spettrale unico. Le osservazioni simultanee della miscela cromosomica combinata sono particolarmente utili per identificare i difetti del cariotipo e possono essere utilizzate per identificare l'aneuploidia e le delezioni e traslocazioni cromosomiche.

Hai appena visto il video di JoVE sulla citogenetica. In questo video, hai imparato a conoscere i principi della citogenetica, tecniche come il cariotipo e la FISH che vengono utilizzate per evidenziare specifiche caratteristiche cromosomiche e le applicazioni di queste tecniche. I recenti progressi nella citogenetica hanno aumentato le loro capacità sia nei laboratori di ricerca che di patologia e continueranno a trovare un uso diffuso in prima linea nella ricerca e nella diagnostica delle malattie. Grazie per l'attenzione!

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